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产品简介：

DNA Shuffling 即 DNA 分子的体外同源重组，它是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)技术。DNA Shuffling 以一个或多个基因为起始材料，通过先随机将这些基因断裂成 DNA 短片段，再进行互为模板和引物的 PCR（无外加引物），最后再进行常规 PCR（外加引物）等处理，最后得到含有大量 DNA 重组突变的 PCR 产物。

产品特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板，无需单独准备各成分。

2.可以用于对长度在 1000 bp 左右的同源片段进行 DNA shuffling。

3.操作手册经过优化，只产生 DNA Shuffling，而将点突变的几率减低到最-低，节省大量优化时间。

4.本产品足够 10 次 DNA Shuffling 反应。

5.DNA Shuffling 试剂盒只适用于科研，不能用于临床。

产品参数：

成分规格包装

DNase I 溶液（1U/μL）10 μL0.5 mL 红盖管

DNA Shuffling 专用反应液 A，10×100 μL0.5 mL 绿盖管

DNA Shuffling 专用反应液 B，10×100 μL0.5 mL 紫盖管

2×DNA Shuffling 专用无引物 PCR

MasterMix1 mL1.5 mL 白盖管

2×DNA Shuffling 专用带引物 PCR

MasterMix1 mL1.5 mL 黄色管

超纯水1 mL1.5 mL 蓝盖管

使用手册1 份无

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限一年。

自备试剂

待突变基因片段、DNA Shuffling 引物（第二轮PCR 引物）、胶回收试剂盒。

使用方法：

1.提前开启 37℃和 90℃水浴或金属浴。一：待突变基因片段的制备

2.待突变基因片段可以用来源于多个物种的、含同源基因片段的 DNA。这些基

因片段可以来于PCR 制备，也可以来于限制性内切酶酶切法制备。

3.这些含同源基因片段（或同源基因片段的一部分）的DNA 片段总长度不要超过 1 kb，同时比 DNA shuffling 终产物（第二轮 PCR 产物）长 200-400 bp，因为第二轮 PCR 的引物位置在此步制备的模板 DNA 内侧 100-200 bp。

4.每次 DNA Shuffling 实验需要 2-5 μg 起始 DNA 片段。如果使用几个同源基因片段，则其比例为 1:1:1，总量保证有 2-5 μg。

5.起始模板 DNA 必须通过胶回收纯化，以便彻-底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等。如果不去除此步的引物，其将对后续 PCR 造成严重干扰。

6.测 OD260 确定模板 DNA 浓度，此溶液为同源基因 DNA 模板，放冰上待用。二：酶切和回收模板 DNA

7.准备 10 μL DNase I 工作液（0.1 U/μL）。将 1 μL 本试剂盒提供的 1 U/μ

L 的 DNase I 溶液和 8 μL 超纯水、1 μL DNA Shuffling 专用反应液 A 混合得浓度为 0.1 U/μL 的 DNase 工作液，放冰上待用。此溶液必须现配现用。

8.在一个 PCR 管中，按顺序加入下列成分：

成分用量

同源 DNA 片段（来于多个不同基因） 2-5 μg DNA Shuffling 专用反应液 A，10×     10 μL DNA Shuffling 专用反应液 B，10×     10 μL

DNase I 工作液（0.1 U/uL）        1 μL补超纯水到100 μL

9.充分轻柔吹打混匀后 37℃保温，分别 5 分钟、6 分钟、7 分钟和 8 分钟取样

（可以根据实际情况适当调整酶切时间），每次取 25 μL 到一个新的 PCR 管中，马上放 75℃（10 min）以灭活 DNase I。

10.在 2-3%琼脂糖凝胶或 10% PAGE 胶上电泳上步所得的 4 个样品（每个 25

μL），根据 DNA 电泳 Marker 锁定的分子量范围，回收 25-150 bp 范围的

DNA 并将其溶解在超纯水中，测 260 nm 得浓度，放冰上待用。

三：无引物PCR

11.在一干净 PCR 管中加入 0.5 μg 回收片段、50 μL DNA Shuffling 专用无引物 PCR MasterMix、补加超纯水到 100 μL。反应总体积为 100 μL。按下面的PCR 反应参数进行第一轮无引物 PCR：PCR 前变性 94℃150 秒，PCR 循环 40 次（94℃ 30s，47.5℃ 45s，72℃ 10 s，每次循环后增加 5s），最后 72℃ 10 分钟。

12.PCR 结束后，取 5-10 μL PCR 产物进行电泳检测，然后对预期长度区域的 PCR 产物进行回收（如果同源区域长度为 800 bp，则回收 600-1000 bp 范围的片段）。此步将去除小片段 DNA 对下轮 PCR 的干扰。

13.预留 25%回收产物原液，剩余的 75%分三份，每份 25%。分别用超纯水将其分别稀释 10 倍、20 倍和 50 倍。

四：带引物PCR

14.分别用上步的原液、10 倍稀释液、20 倍稀释液和 50 倍稀释液各 1 μL 作为

PCR 模板，按下表设置 4 管带引物PCR 反应：

15.按下面的PCR 反应参数进行第一轮无引物 PCR：PCR 前变性 94℃150 秒， PCR 循环 25 次（94℃ 30 s，47.5℃ 45 s，72℃ 60 s，每次循环后增加5 s），最后 72℃ 10 分钟。

16.电泳检测 4 个 PCR 产物，回收预期大小的 PCR 产物（根据引物位置估计预

期大?。?，用于后续克隆和分析实验（略）。

选择我们的DNA Shuffling 试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！