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产品简介：

尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离 200 nt 以下的小片段 RNA，尤其是 20 nt 左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐，为此本公司开发了本产品。

产品特点：

1.一站式，含有电泳所需要的所有试剂，即开即用，十分方便，免去了实验  人员称取有毒物品。

2.灵活，可以根据需要配制各种浓度的 Urea-PAGE，以便对长度各异的RNA 进行电泳。

3.电泳后可直接用于 UV 观察、银染、胶回收、Northern 杂交等实验。

4.使用新型上样缓冲液，可以防止甘油的干扰。

产品参数：

产品规格

本产品第一部分为大纸盒包装，常温运输

成份规格包装

尿素105 g×2250 mL 本色瓶

丙烯酰胺，电泳级60 g125 mL 棕色瓶

甲叉双丙烯酰胺，电泳级3 g10 mL 棕色瓶

TBE 电泳液,10×250 mL250 mL 本色瓶

TEMED1.5 mL1.5 mL 白盖管

过硫酸铵1 g1.5 mL 绿盖管

固相 RNase 清除剂250 mL250 mL 本色瓶

使用手册1 份1 份

成份规格包装

2×miRNA 尿素

-PAGE 上样液1.5 mL1.5 mL 红盖管

miRNA 电泳分子量

标准（15-50 nt）150 μL1.5 mL 蓝盖管

保存和运输

miRNA 尿素-PAGE试剂盒常温运输和保存，其中 miRNAon、miRNA Marker 需要低温运输，-20℃保存，保存期一年。

自备试剂

miRNA 样品、RNase-free 水。

使用方法：

1.准备工作：用固相 RNase 清除剂清洁工作平台

直接将固相 RNase 清除剂原液或 10 倍的新鲜稀释液喷于台面，5 分钟后用普通吸水纸擦净，最后用沾有固相 RNase 清除剂 1000 倍新鲜稀释液的吸水纸擦净，晾干。

2.准备工作：用固相 RNase 清除剂清洁玻璃和塑料器皿将器皿浸泡在固相RNase 清除剂的 10 或 100 倍的新鲜稀释液中，静置处理 5 分钟后取出， 再用固相 RNase 清除剂 1000 倍或 10000 倍新鲜稀释液浸泡二次以上， 倒立晾干后备用。

3.配制 1×TBE 电泳液:将适量的 10×TEB 电泳液用 RNase-free 水稀释 10 倍，得到 1×TBE 电泳液待用。此溶液需要现用现配，否则易长菌。

4.配制 10%过硫酸铵溶液:精确称取约 100 mg 过硫酸铵到一干净的 1.5 mL 离心管中，按每 1 mg 过硫酸铵加 10 μL RNase-free 水的比例加入 RNase-free 水，摇晃溶解待用。10%过硫酸铵溶液有效期不要超过一周。

5.估计所需要的凝胶溶液的体积，一般配制一块 13 cm×15 cm×0.8 mm的胶需要 15 mL 凝胶溶液，配制一块 36 cm×45 cm×0.8 mm 的胶需要 120 mL 凝胶溶液。

6.配制 40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：将 3 g 甲叉双丙烯酰胺全部倒入装有 60 g 丙烯酰胺干粉的瓶中，加入 130 mL 自备的 RNase-free水，充分摇晃混匀即得 40%的 Acrylamide/Bis（20:1）溶液。

7.根据所需要的凝胶溶液的体积，在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分

（此处以配制 100 mL Acrylamide/Bis 终浓度为 15%的凝胶为例）:

成份终浓度用量

尿素7 M42 g

40%Acrylamide/Bis 溶液15%37.5 mL

10×TEB 电泳液1×10 mL

补 RNase-free 水到 100 mL

注:Acrylamide/Bis 的终浓度需要根据待分离 RNA 长度选择(见下表)。

需分离的 RNA 长度范围Acrylamide/Bis 终浓度

6-100 nt20 %

25-150 nt15 %

40-200 nt12 %

8.搅拌并加热到 40-50℃左右，直到尿素完-全溶解。

9.冷却到室温后，将三角瓶接上真空系统抽真空处理 10-15 分钟以充分去除溶液中的氧气（氧气会降低聚合反应效率）。若条件有限，此步可省略。

10.边摇晃溶液变加入 50 μL TEMED 和 500 μL10%过硫酸铵溶液。注意：如果选择其他工作浓度的 Acrylamide/Bis，此二成分的用量不需要随之改变。但如果配置的凝胶溶液的体积变化，此二成分的用量要按比例改变。

11.再充分摇晃约 30 秒后迅速灌胶，然后插入样品梳，室温放置 30-60 分钟等待胶凝固。

12.将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的 1×电泳缓冲液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。

13.拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。

14.在上样前，预电泳 20-30 分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可以使凝胶的温度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 变性状态。

15.将 5 μL miRNA 样品与和 5 μL miRNA 电泳分子量标准（15-50 nt）分别和 5 μL 的 2×miRNA 上样液混合，70℃保温 2-3 分钟后迅速放置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用?？梢栽黾?miRNA 样品的用量，但上液需要等比例增加。

16.关电泳仪后开始上样。10 μL 混合液需要全部上样。

17.重开电泳仪，对 13 cm×15 cm 的胶，以 20-30 mA 的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止；对 36 cm×45 cm 的胶，则以 50-60 mA 的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。

18.染色观察：将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的  凝胶进行各种染色，包括银染（需单独购买试剂盒）、EB 染色（每 100 mL 1×TBE 中加 20 μL 10 mg/mL 的 EB 溶液）、克必隆低毒核酸染料染色（每 100 mL 1×TBE 中加 10 μL 低毒核酸染料）。如果用后两种染色法染色，需要在 UV 下观察并拍照。本产品提供的 miRNA Marker有 5 条带，从上到下的长度分别为：50 nt、40 nt、30 nt、20 nt 和 15 nt。

19.其它

后续处理（本试剂盒不含所需试剂），流程仅仅供参考。

miRNA 回收：在 UV 下确定所需要的 miRNA 条带的位置，切胶后进行胶回收处理（需要单独购买试剂盒）。

Northern 杂交：UV 观察后将凝胶中的RNA 电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。

放射自显影：如果 miRNA 样品电泳前经过同位素标记，则将凝胶一面的玻璃板揭开，用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来，然后包上保

鲜膜，真空抽干，然后使胶跟 X 光片向对置进行放射自显影。

选择我们的miRNA 尿素-PAGE试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！