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产品简介：

本产品是 4×LAMP MasterMix（可视化染料-荧光染料法）和免提取样本 DNA 释放剂的组合。前者含有可视化 LAMP 扩增所需的所有成分，可以用于可视化 LAMP 和荧光染料双染料等温扩增。免提取样本 DNA 释放剂可用于处理各种样品，直接不经过提取直接用于PCR 或 LAMP 扩增。

产品特点：

1.即开即用，用户不需要单独准备每个成分。

2.不需要单独进行核酸纯化，LAMP 扩增后可以直接肉眼观察，不需任何设备。也可以在荧光定量 PCR 仪器上扩增并进行实时结果观察。

3.高特异性，精心优化的可视化染料-荧光染料双染料 LAMP MasterMix 配方，非特异扩增比自配的 LAMP 试剂更低。

4.4×MasterMix，比对应的 2×MasterMix 能使用能多的扩增模板。如果样品没有抑制物，最多可使用 14 ?L 释放液进行扩增，降低漏检的机率。

5.高扩增效率，一般比 PCR 灵敏一个数量级。

6.本试剂盒足够 50 次免提取样本处理和 50 次 20 mL 体系的双染料 LAMP 扩增。

7.提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。

8.免提取 LAMP 试剂盒只能用于科研，不能用于临床。

产品参数：

产品规格

50次

保存和运输

第 1 部分常温运输和保存，第 2 部分低温运输，-20℃保存。有效期一年。

自备试剂

20×免提取 LAMP 引物混合液（靶分子专一）

使用方法：

一、样品 DNA 的制备

1.打开金属浴或PCR 仪，把温度调到 95℃。

2.配制 1 mL 工作液（足够 10 个样品，如果样品不止 10 个，需要按比例增加）： 在一干净的1.5 mL自备塑料离心管中加入10 ?L免提取模板制备溶液A 成分1， 20 ?L 免提取模板制备溶液A 成分 2 和 970 ?L 超纯水，充分混合均匀待用。溶液 A 工作液可室温放置，但最好在一周内用完。

3.标记 10 个PCR 管（方便后续用 PCR 仪加热保温），分别加入 100 ?L 上步所配制的溶液 A 工作液。

4.如果是固体样品，需要确保固体样品被溶液 A 工作液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀即可。动物组织 1-5 mg、鼠尾 2 mm、血液样品不超过 20 mL、植物叶片 1-5 mg、植物种子 1-5 mg、0.2-0.5 ?L 微生物培养物离心所得的沉淀、血清血浆等蛋白浓度高的液体样品 10-30 ?L、其他液体样品（如保存液中的病毒样品）50-100 ?L。对上表未列出的样品，用户需要自己摸索最佳用量。对富含多醌多酚的植物材料（如棉花），使用量最好不要超过 0.5 mg。

5.在金属浴或 PCR 仪上 95℃保温 10 分钟。

6.待冷却到常温。

7.每个管中加入 10 ?L 溶液 B 并轻柔吹打混匀得 DNA 释放液。这些 DNA 释放液可以直接使用，每次用 1-14 ?L，足够进行 50-100 次PCR 或 LAMP 扩增。

二、LAMP 反应（20 μL 体系）

8.反应设置：第一次使用时请把所有 Bst DNA 聚合酶 2.0（50 μL，本试剂盒提供）加入到 4×LAMP MasterMix（双染料法，待加酶）中，轻柔颠倒 20 次充分混匀，然后再取用。如果有 N+2 个 DNA 纯化样品，则最好设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP 扩增阳性对照和 LAMP 扩增阴性对照各 1 个。在 N+4 个 PCR 管中加入下列成分：

9.如果使用金属浴或水浴保温，没有热盖，则每个反应管中加入 50 μL 自备的 PCR

级石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发到管盖下方凝集，反应体积变化， 会严重影响反应效率，增加假阳性率。最后置于 65℃保温 60 分钟进行扩增。

10.如果使用常规PCR 仪进行 LAMP 反应，设置程序时必须打开热盖，设置成 65℃ 保温 60 分钟进行扩增。

11.如果使用荧光定量 PCR 仪，则设置 60 次循环，每次 65℃保温 1 分钟，采集

SYBR 通道的荧光信号。三、结果分析

12.电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除

污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取 10 μL LAMP 扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。LAMP 阳性对照必须有正常LAMP 条带（200 bp 左右的梯形扩增产物），LAMP 阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果 LAMP 阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：

13.可见光（肉眼）分析：样品制备阳性对照和 LAMP 阳性对照的反应液将呈蓝色， 样品制备阳性对照和 LAMP 阴性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见左图（9 为阴性、10 为阳性）。

14.荧光分析（仅限于用 qPCR 仪进行反应的场景）：样品制备阳性对照和 LAMP 阳性对照的反应液将有标准的 S 扩增曲线，样品制备阴性对照和 LAMP 阴性对照的反应液将没呈平线，没有 S 曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的荧光曲线为

S 型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。

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