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产品简介：

本产品是微量包涵体微量纯化试剂盒的中量提取升级产品，用于中量，快速  的从大肠杆菌宿主细胞中提取高质量的包涵体。

产品特点：

1.中量提取，一次可以处理 30-50 mL 的菌液，一次中量提取相当于 10-20 次微量提取。

2.操作简单快速，整个过程只要四十分钟左右。

3.本产品主要用于从大肠杆菌宿主中纯化包涵体，也能用于真菌和其他表达系统  但纯化条件（主要是细胞裂解条件需要自行优化）。

4.能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白所占比重达到 60%以上。

5.本手册提供通过酶法裂解细胞和打断 DNA 的方案，反应更加温和。

6.得到的包涵体可以用于重折叠。

7.中量包涵体纯化试剂盒足够 5 次中量纯化，每次可以处理 30-50mL 菌液。

产品参数：

产品规格

保存和运输

常温运输及保存，但溶菌-酶和 Benzonase 需要低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂

无

使用方法：

准备工作：

一次中量提取需要 5 mL 包涵体纯化溶液 A，用前按每 mL 加入 120mg 溶菌-酶的比例加入所需量的溶菌-酶干粉并摇晃溶解待用。溶菌-酶的溶液非常容易衰变，  所以最好现配现用，没用完的只能在-20℃放一周。包涵体中的重组蛋白一般比溶解  状态中的蛋白质更能够抵抗微量内源性蛋白水解酶的降解，如果实验发现得到的重  组蛋白确有降解，则需要在包涵体纯化溶液 A 中新鲜加入自备的蛋白酶抑制剂混合物。

一．细胞裂解和包涵体的纯化：

1.在蛋白诱导期结束时，转移 30=50 mL 菌液到一个干净的塑料离心管中。

2.7,000 rpm 室温离心 3 分钟，小心弃上清。

3.加入 5 mL 含 120mg/mL 溶菌-酶的包涵体纯化溶液 A 重悬细胞。

4.室温放置 10-20 分钟裂解细菌，其间可以用手轻弹离心管混匀。

5.-20℃冷冻至凝固，一般需要 1 小时。凝固有利于裂解细菌，所以一定要凝固到细菌溶液变成固体。

6.室温水浴解冻。如果裂解充分，细菌释放出的 DNA 将使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要重复冻融步骤，否则完整细菌将和包涵体一  起沉淀，影响包涵体的纯度。最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。

7.加入 25 uL 的 Benzonase （1U/uL），脱色摇床上摇晃直到裂解液不再粘稠，一般需要 30 分钟左右（检查方式是将裂解物倾倒转移到另一离心管中，在转移过程中看其是否粘稠）。

8.5,000-7,000 rpm 4℃离心 5 分钟，小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为 SDS-PAGE 对照样品。

9.将沉淀（主要由包涵体构成）悬浮在 25 mL 的包涵体纯化溶液 B 中，轻柔混匀后室温放置 5 分钟。

10.5,000-7,000 rpm 4℃离心 10 分钟，小心收集上清,可以作为包涵体第一次洗涤的对照样品。

11.将沉淀（主要由包涵体构成）悬浮在 25mL 的包涵体纯化溶液 B 中，轻柔混匀后室温放置 5 分钟。

12.5,000-7,000 rpm 4℃离心 10 分钟，小心收集上清作为包涵体第二次洗涤的对照样品。一般洗涤两次就能够得到足够纯净的包涵体，如果需要更多洗涤，需要用户单独购买包涵体洗涤液（包涵体纯化溶液 B）。

13.得到的沉淀即为包涵体，可以长期放置在冰箱待用或直接进入包涵体的溶解步  骤。

二．包涵体的溶解

14.在包涵体沉淀中加入 5 mL 包涵体溶解液，用枪头充分吹打后漩涡震荡。如果低温放置，包涵体溶解液会产生沉淀，必须 45-65℃溶化并混匀后才能使用。

15.室温放置 1 小时使蛋白质充分溶解。

16.20000g 4℃离心 20 分钟，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：检查离心管能否承受此离心力。脱盐处理上清后进行 SDS-PAGE 检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完-全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。注意：包涵体溶解液含 6M 盐酸胍，溶解蛋白能力强于含 8M 尿素的溶解液，但 SDS-PAGE 时不能直接上样，需要先脱盐?？突б部梢杂米员改蛩嘏渲?8-10 M 尿素的溶液（尿素溶液不稳定，所以不能长期放置）溶解包涵体，得到的溶解液可以直接用于 SDS-PAGE 电泳。但其溶解能力弱于盐酸胍。

17.  得到的脱氧后的蛋白质溶液可以用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的优良复性条件，所以本公司不能提供统一的复性溶液，需要用户自己摸索。注  意：包涵体纯化过程中引入了溶菌-酶、核酸酶 Benzonase 等外源蛋白质，在

SDS-PAGE 分析时可能有额外条带出现。

选择我们的中量包涵体纯化试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！