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產(chǎn)品簡介：

某些 DNA 聚合酶具有不依賴于模板的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在只有 dTTP 存在的情況下，可以在平末端的 DNA 片段的兩個 3’端各加上一個 dT 尾巴。本產(chǎn)品就是利用此原理開放的加 T 試劑盒，主要用于制備 T 載體或在平末端的 DNA 片段上加上 1 個 T 尾巴。

產(chǎn)品特點：

1.簡單, 2X 加 T 預(yù)混合液中含有所需要的所有成分（包括酶），不需要單獨準(zhǔn)備。

2.各成分優(yōu)良用量經(jīng)過優(yōu)化，用戶不需要單獨調(diào)試。

3.適用于任何平末端的 DNA 片段，包括 Pfu DNA 聚合酶等高保真 DNA 聚合酶合成的 DNA 片段或限制性內(nèi)切酶酶切回收得到的 DNA 片段。

4.加 T 后的載體可以作為 T 載體使用。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運輸

DNA 片段加T試劑盒低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。

自備試劑

平末端 DNA 片段、平末端質(zhì)粒 DNA、自備超純水。

使用方法：

一：反應(yīng)前純化處理：

1.平末端 DNA 片段或平末端質(zhì)粒 DNA 可以采取膠回收和酚/氯仿抽提法等常規(guī)方法純化，最后溶解在水或TE 中，終濃度以 0.1 ug/uL 為宜。必須注意的是, 用 Vent, Deep Vent, Pfu, Pwo 等具有 3 到 5 外切活性的 DNA 聚合酶擴增得到的 DNA 片段，必須經(jīng)過徹-底的去除殘留的酶的處理過程（如酚/ 氯仿抽提或 Proteinase K 處理），否則它們將在加 T 反應(yīng)時，將切除掉加上的 T 尾巴，干擾反應(yīng)。

2.本產(chǎn)品的加尾酶在 DNA 的 3’末端的核苷酸為 T 時，加 T 效率更高，故如果有可能，最好滿足此要求。

二：加 T 反應(yīng)

3.在干凈的0.5 mL或1.5 mL離心管中，分別加入回收的DNA 片段(0.2-2 ug)、 25 uL 2 X 加 T 緩沖液、最后補水到 50 uL，在 PCR 儀上 72℃保溫 2 小時。如果用金屬浴或水浴，必須加 50uL 石蠟油，否則水分在反應(yīng)過程中將蒸發(fā)， 影響加尾效率。

4.加 T 反應(yīng)后，加尾酶將與 DNA 末端緊密結(jié)合，所以必須酚/氯仿抽提去除。如果使用 Proteinase K 處理后再用酚/氯仿抽提效果會更好。得到的 DNA溶于適量水和 TE 中后即可用于后續(xù)連接反應(yīng)。由于加一個 T 不會改變 DNA

片段的瓊脂糖電泳速度，故不能通過跑電泳檢測加尾效果。

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