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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑是一種通過化學(xué)處理，高效快速制備釀酒酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，用于長期凍存以備后續(xù)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.一次制備，-80℃保存，多次使用，免去每次轉(zhuǎn)化都要制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞。

2.操作簡(jiǎn)單，單溶液制備，除酵母培養(yǎng)的時(shí)間外，整個(gè)操作只需要 30 分鐘

3.主要用于釀酒酵母 S. cerevisiae，也適用于其他多種實(shí)驗(yàn)用酵母菌株，包括

S. pombe、C. albicans、Pichia pastoris 等。

4.受體酵母可以不含質(zhì)粒，也可用于攜帶有選擇性質(zhì)粒的酵母（如雙雜交體系中的酵母）。

5.對(duì)釀酒酵母，最高轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到 0.2-1×105 個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug 質(zhì)粒 DNA。對(duì)其他酵母，效率稍低，范圍在 100-2000 個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug 質(zhì)粒 DNA。

6.得到的感受態(tài)細(xì)胞可以用各種線性或環(huán)狀酵母穿梭質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如

YIp, YRp, YCp, YEp 和 YAC 等。

7.可以用于酵母雙雜交、定點(diǎn)突變（Site－Directed Mutagenesis）、基因破壞

（Gene Disruption）、等位突變基因修復(fù)（Mutant Allele Recovery）等實(shí)驗(yàn)。

8.酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒可以制備 20 只酵母感受態(tài)細(xì)胞（需要 200mL 酵母培養(yǎng)液），并還帶高效轉(zhuǎn)化液。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運(yùn)輸

常溫運(yùn)輸和保存，有效期一年。

自備試劑

YPD 培養(yǎng)基

使用方法：

一：酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備

說明：按本方法制備 1 管酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞就需要 OD600 達(dá)到 0.6-1.0 的新鮮酵母培養(yǎng)液 10 mL，用戶需根據(jù)所需酵母感受態(tài)細(xì)胞的數(shù)量決定培養(yǎng)細(xì)胞的體積。

如果超過 10 mL，則制備液的使用量需要按比例增加。

1.挑取酵母受體菌的新鮮的單菌落（4℃放置不超過 3 周的也可以），接種到裝在 50mL 離心管中的 10 mL 的自備的 YPD 培養(yǎng)基中。

2.30℃搖晃培養(yǎng)，搖床速度 250 rpm/分鐘，直到 OD600 達(dá)到 0.6-1.0（相當(dāng)于 0.6-1×107 細(xì)胞/mL）。

3.室溫 3000 rpm 離心 5 min，棄上清得酵母細(xì)胞沉淀。

4.新鮮制備適量的酵母感受態(tài)制備工作液。對(duì) 10 mL 酵母需要 5.25 mL 的工作液，其配制方法是：將 4.75 mL 酵母化學(xué)感受態(tài)制備液A、0.25 mL 酵母化學(xué)感受態(tài)制備液 B 和 0.25 mL 酵母化學(xué)感受態(tài)制備液 C 加入到一個(gè)無菌的離心管中后充分震蕩混勻即可。酵母感受態(tài)制備工作液可放室溫待用。

5.用 0.5 倍體積的新鮮配制的酵母感受態(tài)制備工作液洗滌酵母細(xì)胞沉淀一次

（對(duì) 10 mL 酵母則需要 5 mL 酵母感受態(tài)制備工作液）。即混合后振蕩 1

分鐘，室溫 3000rpm 離心 3 分鐘，去上清得洗滌后的酵母細(xì)胞沉淀。

6.再用 0.02 倍體積的酵母感受態(tài)制備工作液充分重懸菌體（對(duì)10 mL 酵母， 則需要 0.2 mL 酵母感受態(tài)制備工作液）。

7.按每管 0.2 mL 分裝到冷凍管中，放入保溫冰盒中冷卻半小時(shí)后再放入

-80℃冰箱待用。0.2 mL 的感受態(tài)細(xì)胞足夠 1 次轉(zhuǎn)化使用。注意：放入保溫冰盒的目的是使溫度緩慢下降，急凍將使轉(zhuǎn)化效率降低，這點(diǎn)跟大腸桿菌感受態(tài)制備過程不同。

二：化學(xué)轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

1.將總體積不超過20 uL的0.1-5 ug 質(zhì)粒DNA加到剛從-80℃冰箱取出的、還處于凝固狀態(tài)的 0.2 mL 酵母感受態(tài)細(xì)胞上。注意：最好同時(shí)做一個(gè)不加質(zhì)粒 DNA 的陰性對(duì)照組。

2.室溫充分振蕩直到凝固的感受態(tài)細(xì)胞完-全融化。注意：此步非常關(guān)鍵，如果能在恒溫振蕩器上 37℃振蕩 5 分鐘，則效果更好。

3.加入 1.4mL 酵母化學(xué)感受態(tài)轉(zhuǎn)化液A，輕柔顛倒混勻一分鐘。

4.30℃培養(yǎng) 1 小時(shí)。

5.室溫 3000g 離心 5 分鐘，棄上清。

6.在酵母細(xì)胞沉淀中加 1.0 mL 酵母化學(xué)感受態(tài)轉(zhuǎn)化液 B，振蕩一分鐘。

7.室溫 3000g 離心 5 分鐘，棄上清。

8.在酵母沉淀細(xì)胞中加入適量（如 100 uL）的酵母化學(xué)感受態(tài)轉(zhuǎn)化液 B， 混勻后在在選擇培養(yǎng)基上全部涂盤。

9.30℃培養(yǎng) 3-5 天后即得酵母轉(zhuǎn)化菌落。

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