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產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品為 CHAPS 細(xì)胞裂解和免疫沉淀緩沖液，用于裂解動物培養(yǎng)細(xì)胞制備總蛋白抽提物。

產(chǎn)品特點：

1.其最大特點是提取的總蛋白可以保持蛋白和蛋白復(fù)合體的構(gòu)型，非常適合后續(xù)的免疫共沉淀實驗和酶活性檢測。

2.不含氨基成分，可使用 NHS-ester 類的交聯(lián)試劑。

3.跟 Bradford 法、Lowry 法和 BCA 法蛋白濃度測定試劑兼容。

4.裂解跨膜和細(xì)胞膜蛋白質(zhì)提取后保持分子間的相互作用。本試劑在反應(yīng)過程中能保持蛋白質(zhì)構(gòu)象以及蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝。

5.250mL 規(guī)格足夠處理 800 個 10cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞樣本。

6.起始材料可使用培養(yǎng)細(xì)胞，也可以使用實體組織。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

保存和運輸

低溫運輸，4℃保存，有效期為 12 個月。

自備試劑

蛋白酶抑制劑或/和蛋白磷酸酶抑制劑、PBS、自選免疫沉淀抗體、免疫沉淀珠（G 蛋白或 A 蛋白珠）、離心機(jī)、細(xì)胞刮子、冷藏室或冷藏箱等。

使用方法：

一、實驗準(zhǔn)備

1.根據(jù)靶蛋白的特點，將自備的蛋白酶抑制劑或/和蛋白磷酸酶抑制劑加入到本產(chǎn)品（CHAPS細(xì)胞裂解及免疫共沉淀緩沖液）中，使其終濃度達(dá)到這些抑制劑的工作濃度，混勻后放冰上待用。同時將其他所需物品（如細(xì)胞刮子，離心管、Dounce 玻璃勻漿器等）進(jìn)行預(yù)冷。下述所有溶液均為預(yù)冷溶液，所有離心均為 4℃離心。

二：培養(yǎng)細(xì)胞樣本的裂解

2.用 1-3 個 10cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，待其匯合度達(dá)到 80-90%時為止。

3.按標(biāo)準(zhǔn)流程用PBS 洗滌細(xì)胞三次，每次用 5mL PBS。此步可去除殘留的培養(yǎng)基血清蛋白以避免在后續(xù) Western 印跡雜交時出現(xiàn)血清蛋白條帶。

4.在每個培養(yǎng)皿中加入 300μL 補加了蛋白酶抑制劑或/和蛋白磷酸酶抑制劑的本產(chǎn)品，輕柔傾斜和旋轉(zhuǎn)讓緩沖液覆蓋細(xì)胞表面，然后用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管中。

5.冰上放置 10 分鐘。每隔 2-3 分鐘用手指彈擊離心管數(shù)次以讓細(xì)胞膜充分溶解， 然后直接進(jìn)入第 8 步操作。注意不要渦旋震蕩，避免蛋白變性或蛋白復(fù)合體解離。

三、實體組織樣本的裂解

6.對冷凍的實體組織：將 100mg 在-80℃或液氮冷凍的實體組織放在裝有液氮的研缽中研磨成粉末，再轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 Dounce 玻璃勻漿器中，加入 300μL 預(yù)冷的補加了蛋白酶抑制劑或/和蛋白磷酸酶抑制劑的本產(chǎn)品，溫和手動勻漿 6 次后冰浴 30 分鐘，每間隔 5 分鐘搖晃一次，然后直接進(jìn)入第 8 步操作。

7.對新鮮的實體組織：用自備的預(yù)冷PBS 洗滌100mg 經(jīng)過胰-酶處理的新鮮組織， 3000g 4℃離心 5 分鐘，棄上清。在組織沉淀中加入 300μL 預(yù)冷的補加了蛋白酶抑制劑或/和蛋白磷酸酶抑制劑的本產(chǎn)品，輕柔吹打 3 次，在冰上用Dounce 玻璃勻漿器輕柔勻漿后冰浴 30 分鐘，每間隔 5 分鐘搖晃一次，然后直接進(jìn)入第 8 步操作。

四、免疫共沉淀

8.用最高離心速度離心上步所得細(xì)胞裂解液 15 分鐘，將上清液轉(zhuǎn)換到預(yù)冷的

1.5mL 離心管中。

9.分 30μL 上清液做對照 A，剩余的樣本用于免疫沉淀。預(yù)留的對照 A 可以放冰上待用，如果當(dāng)天沒用完，可以放﹣20℃或﹣80℃長期保存。后續(xù)的對照 B 和對照 C 處理相同。

10.在上清液中加入所選免疫沉淀抗體（優(yōu)良抗體用量需自行摸索），輕柔顛倒混勻 30 秒后放搖床上在冷藏室或冷藏箱內(nèi)搖晃至少 15 分鐘，使抗體和上清液中的靶蛋白充分結(jié)合。如果有多管相同的重復(fù)樣本，后續(xù)實驗一樣，可以匯集在一起后加入抗體。如果后續(xù)實驗不同，則最好不要匯集。

11.按 300μL-2mL 混合液加 60μL 免疫沉淀珠的比例加入免疫沉淀珠，輕柔顛倒搖晃30 秒后放搖床上在冷藏室或冷藏箱內(nèi)搖晃至少30 分鐘以讓免疫沉淀珠和靶蛋白-抗體形成復(fù)合物。

12.3000rpm 離心 5 分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的 1.5mL 離心管中作為對照 B 預(yù)留，沉淀為蛋白-抗體-沉淀珠復(fù)合物。注意：吸取上清時不要觸及蛋白-抗體- 沉淀珠復(fù)合物沉淀。

13.向復(fù)合物沉淀中加入 300μL 含蛋白酶抑制劑的本產(chǎn)品，180 度輕柔旋轉(zhuǎn)離心管 3 次，3000rpm 離心 5 分鐘，保留上清液作為對照 C。

14.重復(fù)上步洗滌步驟至少 2 次，這兩次的上清液不需要保留。

15.最后一次洗滌后，14000 rpm 離心 15 分鐘使復(fù)合物沉淀充分沉淀，再吸棄殘留上清液。

16.復(fù)合物沉淀可立即用自選的方法進(jìn)行靶蛋白洗脫。如果后續(xù)實驗為PAGE 電泳， 可以用 1×PAGE 上樣液洗脫。在每 60uL 免疫沉淀珠得到的沉淀中加入100uL 上樣液，渦旋震蕩 30 秒，60℃保溫 10 分鐘，3000rpm 離心 5 分鐘，上清即含有洗脫的靶蛋白和其抗體。

17.洗脫的靶蛋白可用于 PAGE 電泳、Western 雜交和活性檢測等后續(xù)實驗，也可以放﹣20℃或﹣80℃長期保存。注意：用洗脫的靶蛋白進(jìn)行后續(xù)實驗時需要用三個對照樣本一起實驗。Western 雜交時，最好選擇跟本次實驗所用抗體不一

樣的抗體。

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