诺博莱德 IIImiRNAFirstStandSynthesisKit反转录试剂

Script III miRNA1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）茎环法 miRNA 第一连反转录试剂盒

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产品内容

保存条件

-20℃保存，有效期 12 个月。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

产品简介

Script III miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）采用第三代高效逆转录酶，具有更强的延伸能力和稳定性，并配备了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作， 即可同时完成基因组清除与茎环法miRNA逆转录反应，操作方便快捷。逆转录产物可以用于后续的染料法或探针法荧光定量检测。此方法特异性高只对成熟的miRNA进行反转，不受其前体干扰，序列高度同源的miRNA也可精确区分。本试剂盒具有可从20 pg ~ 2 μg的total RNA中高效制备miRNA对应的第一链cDNA。

原理：本试剂盒采用茎环结构的逆转录引物与 miRNA 分子的3’端 结合，并在逆转录酶的作用下进行反应，获得人为加长的 miRNA 第一链 cDNA。

引物的制备：

需要自己设计、合成用于反转录的颈环引物！

microRNA茎环引物及Realtime-PCR引物设计方法如下：

1. stem-loop RT引物设计：

基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可。通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC。

例如设计miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用茎环序列后加上miRNA3’末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACATACAT。

2. realtime 上游引物设计：

miRNA序列除去3’端6个碱基 的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为(注意 把U改为T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的Tm 值（一般参考DNAMAN），如果Tm值较低，则在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可设计 为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

下游引物是通用的，序列为GTGCAGGGTCCGAGGT。

引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将PCR产物进行电泳检测产物是否单一（产物长度很短，需要3%以上的琼脂糖胶）

操作步骤： (以20 μl反应体系为例)

1．茎环法反转录体系的配制

使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：(使用前，请将各组分轻弹混匀，点甩离心收集至管底，置冰上备用。)

2．轻柔吸打混匀，点甩离心，置 PCR 仪进行逆转录反应。

25℃孵育 5 min 后， 42℃孵育 20 min，85°C 加热 5 sec，失活 RTase 和 dsDNase，终止反应。

3．合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存，也可以直接进行下游PCR或者荧光定量qPCR检测。

注意事项：

1. 在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA 。

2. 此过程也可以使用小分子RNA， miRNA无法直接用分光光度计定量，建议加入量为2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA 样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8 μl。

3.  5 × miRT Reaction Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。可以每次按照3.6-3.8μl使用，也不影响使用效果。

按照miRNA荧光定量PCR检测试剂盒(货号P501)进行qPCR。

注：按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时，可以根据实际情况选择使用量，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，可根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果发现有非特异扩增条带，或者融链曲线显示有非特异扩增，往往提示cDNA模板过量，可以尝试将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。

IIImiRNAFirstStandSynthesisKit反转录试剂