氨基bi林-N-脱甲基酶（AND）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/24 样

氨基bi林-N-脱甲基酶AND试剂盒P450

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

细胞色素P450 酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND 作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4 亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。

测定原理：

AND 催化氨基bi林释放甲醛，通过 Nash 比色法测定甲醛含量，即可计算出 AND 活性。

组成：

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 50ml 蒸馏水充分溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶（棕色瓶），4℃避光保存。临用前加入 2.6ml 无水乙醇，充分溶解。试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2.6ml 蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1 瓶，室温保存。临用前加蒸馏水 10ml 充分溶解。

标准液：液体×1 瓶，-20℃保存。临用前取 1.5ml EP 管，加入 10μl 标准液，加 990μl 蒸馏水，混匀即为0.05 mmol/L 标准甲quan溶液，4℃保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、1ml 玻璃比色皿、蒸馏水、无水乙醇和冰。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1ml 试剂一，冰上充分研磨，10000g 4℃

离心 30min，取上清液转入超速离心管。

2、粗制微粒体：4℃，10000g，离心 60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1ml 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，10000g 离心 30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5ml，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

AND 活性测定操作：

分光光度计预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。

试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。

对照管：取 1 支EP 管，加入 50μl 粗酶液，850μl 试剂二，50μl 试剂三，50μl 蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温 30min；立即加入 175μl 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 175μl 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取新的 EP 管，加入 500μl 上清液，500μl 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为 A 对照管。

测定管：取 1 支EP 管，加入 50μl 粗酶液，850μl 试剂二，50μl 试剂三，50μl 试剂四，混匀后置于37℃水浴保温 30min；立即加入 175μl 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 175μl 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取 1 支新EP 管，加入 500μl 上清液，500μl 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为A 测定管。

标准管：取 1 支EP 管，加入 500μl 标准品，500μl 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为A 标准管。

注意：每个样品都需要做对照管。

AND 活性计算：

按照蛋白浓度计算:

活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

AND 活性(nmol/min/mg prot)= C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（Cpr×V样）÷T

= 45×（A 测定管－A 空白管）÷A 标准管÷Cpr

按照样本质量计算:

活性单位定义：37℃中每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

AND 活性(nmol/min/g 鲜重)= C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T

= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W

C 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 标准品：500μl=0.0005 L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度mg/ml，需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入粗酶液体积，50μl=0.05ml；W：样本质量，g ；T：反应时间，30min。

注意事项：

1、粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤 3 的沉淀中加 0.5ml 20%的甘油，分装后，

-80℃保存；

2、试剂三和试剂四需临用前配制，如当天没有用完，4℃避光保存，可用 1 周；

3、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议用 BCA 法测蛋白含量。

氨基bi林-N-脱甲基酶AND试剂盒P450