酸性蛋白酶（Acid protease, ACP）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/24 样

酸性蛋白酶试剂盒 蛋bai酶系列

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

ACP 是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、酱油酿造、饲料等。

测定原理：

酸性条件下，ACP 催化酪蛋白水解产生酪an酸；在碱性条件下，酪an酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在 680nm 有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算 ACP 活性。

组成：

试剂一的配制：临用前按液体一：液体二：蒸馏水=76（μl）：17（μl）：18（ml）的比例配制，现配现用，如出现白色絮状沉淀则不能用。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 10 ml 蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 20 ml 试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用）。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 50 ml 蒸馏水溶解。

标准品：液体 1ml×1 支，0.25 μ mol/ml 标准酪an酸溶液，4℃保存。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1ml 玻璃比色皿、1.5 ml EP 管和蒸馏水。

粗酶液提?。?/span>

试剂一的配制：见试剂的组成和配制。

组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。

血清或培养液：直接测定。

细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

分光光度计预热 30min，调节波长到 680 nm，蒸馏水调零。

试剂二、试剂三和试剂四置于 30℃水浴保温 30min。

对照管：取一支EP 管，加入 100μl 粗酶液，200μl 试剂二，混匀后置于 30℃水浴保温 10min；加入200μl 试剂三，混匀后 8000g， 4℃离心 10min；取 200μl 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μl 试剂四，200μl 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为 A 对照管。

测定管：取一支EP 管，加入 100μl 粗酶液，200μl 试剂三，混匀后置于 30℃水浴保温 10min；加入200μl 试剂二，混匀后 8000g， 4℃离心 10min；取 200μl 上清液，加入新的 EP 管，再加入 1000μl 试剂四，200μl 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为A 测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）

空白管：取 EP 管，加入 200μl 蒸馏水，1000μl 试剂四，200μl 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为A 空白管。

标准管：取 EP 管，加入 200μl 标准品，1000μl 试剂四，200μl 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，于 680nm 测定光吸收，记为A 标准管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。

ACP 活性计算公式：

1. 按照样本蛋白浓度计算

ACP 活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min /mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr 2．按照样本质量计算

ACP 活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min /g 鲜重）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷

（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W

3. 按照液体体积计算

ACP 活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min/ml）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷V1÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）

按照细胞数量计算

ACP 活性单位定义：30℃每 104 个细胞每分钟催化水解产生 1nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

ACP 活性（nmol/min /104 cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷

（细胞数量×V1÷V2）÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量

C 标准品：0.25 μ mol/ml 标准酪an酸溶液；V 反总：酶促反应总体积，0.5ml；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/ml）； V1：加入反应体系中粗酶液体积（ml），0.1 ml；V2：提取液总体积（ml），1ml；T：催化反应时间（min）， 10min；W：样品质量（g）。

注意事项：

试剂一按操作指示配制，用多少配多少，出现白色絮状沉淀则不能用。

临用前配制的试剂配置好后 3 天内使用完毕。

酸性蛋白酶试剂盒 蛋bai酶系列