单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroasorbate reductase，MDHAR）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

单脱氢抗坏血酸还原酶试剂盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

MDHAR 催化MDHA 还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

测定原理：

MDHAR 催化 NADH 还原MDHA 生成 AsA 和NAD⁺，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但是 NAD⁺没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率，来计算出 MDHAR 活性。

组成：

试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 5ml 蒸馏水充分溶解。试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5ml 蒸馏水充分溶解。

试剂五：液体 25μl×1 瓶，4℃保存。临用前加 5ml 试剂二充分溶解。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1ml 石英比色皿、可调式移液枪和双蒸水

粗酶液提?。?/span>

组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g ，4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。

血清等液体：直接测定。

MDHAR 测定操作：

分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

依次在比色皿中加入 100μl 试剂三、100μl 试剂四、100μl 试剂五和 600μl 试剂二，最后加入 100μl 上清液，迅速混匀后于 340nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值A1 和A2，△A=A1-A2。

MDHAR 活性计算公式：

按蛋白浓度计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷（Cpr×V 样）÷T

= 804×△A ÷Cpr

按样本质量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 804×△A ÷W

按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T

= 804×△A ÷ 细胞数量

按液体体积计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /ml) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样）÷T

= 804×△A

ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，1ml=0.001 L， V 样：加入反应体系中上清液体积，100μl=0.1ml；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒；V 样总：加入提取液体积，1ml；W，样本质量，g；T：反应时间，2min。

注意事项：

临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。

单脱氢抗坏血酸还原酶试剂盒