果糖-6-磷酸激酶（6-phosphofructokinase，PFK）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

果糖-6-磷酸激酶试剂盒 糖酵解

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP 转化为果糖-1,6 二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

测定原理：

PFK 催化果糖-6-磷酸和ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙tong酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成NAD⁺，在 340nm 下测定NADH 下降速率，即可反映PFK 活性。

组成：

自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

在试剂二瓶中加入 17ml 试剂一和 1.13ml 蒸馏水充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

在试剂三中加入 1ml 蒸馏水充分混匀，冰上放置备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

在试剂四中加入 1ml 蒸馏水充分混匀，冰上放置待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 样本、10μl 试剂三、10μl 试剂四和 170μl 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值A1 和 10min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：不同匀浆组织中 PFK 活力不一样，做正式试验之前请做 1-2 只预试，若ΔA>0.5，则说明活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min 或 5min,使ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。

PFK 活力单位的计算：

用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、血清（浆）PFK 活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=321×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算：

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=321×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V 样÷V 样总)÷T=0.1605×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。

用 96 孔板测定的计算公式如下：

1、血清（浆）PFK 活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=642×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算：

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和

1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=642×ΔA÷Cpr

按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=642×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V 样÷V 样总)÷T=0.321×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。

果糖-6-磷酸激酶试剂盒 糖酵解