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羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀說明書

閱讀:196        發(fā)布時間:2025-6-10

羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀說明書

一、儀器概述

羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀是一種基于實時熒光定量PCR(qPCR)技術的分子生物學檢測設備,用于核酸(DNA/RNA)的擴增和定量分析。該儀器采用光學檢測系統(tǒng),可在PCR擴增過程中實時監(jiān)測熒光信號變化,并通過軟件分析計算目標核酸的初始濃度。

LightCycler® 480適用于醫(yī)學診斷、基礎研究、食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)測等領域,支持多重PCR檢測,滿足不同實驗需求。


二、儀器組成

1. 硬件部分

  • 溫控模塊:采用Peltier半導體溫控技術,控溫范圍通常為4°C–99°C,升降溫速率可達4.8°C/秒(視具體型號)。

  • 光學檢測系統(tǒng)

    • 激發(fā)光源:LED或鹵素燈(視型號)。

    • 檢測通道:通常支持4–6個熒光通道(如FAM、HEX、ROX、Cy5等),可同時檢測多種熒光信號。

  • 樣本承載系統(tǒng):兼容96孔板或384孔板(視型號),部分版本支持多模塊并行運行。

  • 觸摸屏控制面板(部分型號):可直接進行基本操作和程序設定。

2. 軟件部分

  • LightCycler® 480 Software:提供實驗設置、數據采集、分析和報告生成功能。

    • 支持絕對定量、相對定量、熔解曲線分析、基因分型等模式。

    • 可導出數據至Excel、PDF等格式。


三、工作原理

實時熒光定量PCR(qPCR)通過監(jiān)測PCR擴增過程中熒光信號的累積來定量目標核酸。LightCycler® 480采用以下兩種主要檢測方式:

  1. 基于探針的檢測(如TaqMan探針):探針與目標序列結合后,在擴增過程中被酶切,釋放熒光信號。

  2. 基于染料的檢測(如SYBR Green):染料結合雙鏈DNA后發(fā)出熒光,但可能受非特異性擴增影響。

儀器在每輪PCR循環(huán)后采集熒光信號,生成擴增曲線,并通過閾值循環(huán)數(Ct值)計算初始模板量。


四、操作流程

1. 實驗前準備

  • 樣本處理:提取DNA/RNA,測定濃度和純度(如A260/A280比值)。

  • 試劑準備

    • 選擇合適熒光標記(探針或染料)。

    • 配制PCR反應體系(模板、引物、探針、酶、dNTPs、緩沖液等)。

  • 耗材選擇:使用適配的96孔板或384孔板,避免氣泡影響信號檢測。

2. 儀器設置

  1. 開機與初始化

    • 打開儀器電源,啟動軟件,進行光學校準(如需要)。

  2. 創(chuàng)建實驗程序

    • 設定PCR循環(huán)參數(預變性、變性、退火/延伸、循環(huán)次數)。

    • 選擇熒光檢測通道(如FAM、HEX)。

  3. 樣本排布

    • 在軟件中設定樣本位置,標注標準品、待測樣本、陰性/陽性對照。

3. 運行PCR

  • 將反應板放入儀器,啟動運行。

  • 實時監(jiān)測擴增曲線和熒光信號。

4. 數據分析

  • 擴增曲線分析:軟件自動計算Ct值,生成標準曲線(絕對定量)或ΔΔCt值(相對定量)。

  • 熔解曲線分析(如使用SYBR Green):確認擴增特異性。

  • 數據導出:保存或打印結果。


五、應用領域

  1. 醫(yī)學診斷

    • 病原體檢測(如新冠病毒、HIV、HBV)。

    • 遺傳病篩查(如地中海貧血、囊性纖維化)。

  2. 科研實驗

    • 基因表達分析(qRT-PCR)。

    • SNP分型、突變檢測。

  3. 食品安全與農業(yè)

    • 轉基因成分檢測。

    • 食源性致病菌(如沙門氏菌、大腸桿菌)鑒定。

  4. 環(huán)境監(jiān)測

    • 水體或土壤中的微生物檢測。


六、注意事項

1. 實驗優(yōu)化

  • 引物/探針設計:確保特異性,避免二聚體或非特異性擴增。

  • 反應體系優(yōu)化:調整Mg2?濃度、退火溫度等參數。

2. 防污染措施

  • 分區(qū)操作(試劑配制區(qū)、樣本處理區(qū)、擴增區(qū))。

  • 使用UNG酶(尿嘧啶-DNA糖基化酶)防污染體系。

3. 儀器維護

  • 日常清潔:定期用無塵布擦拭樣本槽和光學部件。

  • 校準:定期進行光學校準和溫度驗證。

  • 避免長時間高負荷運行,以延長設備壽命。


七、常見問題與解決方案

問題可能原因解決方法
無熒光信號試劑失效、探針降解更換新鮮試劑,檢查探針質量
擴增曲線異常模板降解、PCR抑制物重新提取核酸,優(yōu)化純化步驟
重復性差加樣誤差、溫度不均使用排槍精確加樣,檢查溫控模塊

八、技術參數(以LightCycler® 480 II為例)

  • 溫控范圍:4°C–99°C

  • 升降溫速率:最高4.8°C/秒

  • 檢測通道:6色熒光(FAM、HEX、ROX、Cy5等)

  • 通量:96孔或384孔(視型號)

  • 數據輸出:Ct值、熔解曲線、基因分型等


九、總結

羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR儀通過高精度溫控和多重熒光檢測,為核酸定量分析提供穩(wěn)定可靠的技術支持。其應用范圍廣泛,但實驗結果的準確性依賴于合理的實驗設計、規(guī)范操作和定期維護。用戶應根據具體需求選擇合適的檢測模式和耗材,并遵循標準化流程以確保數據可靠性。


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