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货号： HG-PG001
PG13细胞系是由小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）整合莫洛尼氏白血病毒（MLV）表达载体和长臂猿白血病病毒（GALV）胞膜蛋白基因改造而获得的。PG13细胞作为一种包装细胞目前主要应用于细胞产品（如CAR-T/TCR-T细胞等）的开发。因此相关生物制品需要对其进行PG13细胞DNA残留的含量进行检测。
本试剂盒配套有PG13 DNA定量参考品可快速准确定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中PG13残留DNA。
配套样品前处理试剂盒（货号为HG-CL100）进行样品的前处理。
检测范围：3 fg/μL ~ 3×105 fg/μL
100 Reactions
| 组分 | 规格 | 存储条件 |
|---|---|---|
| PG13 DNA 定量参考品（30ng/μL） | 50μL×1 管 | -20℃ |
| PG13 Primer&Probe Mix | 550μL×1管 | -20℃ |
| 2x qPCR Reaction Buffer | 1.6mL×1 管 | -20℃ |
| DNA稀释液 | 1.5mL×3 管 | -20℃ |
存储条件见上表，有效期12个月。开封后未使用完的试剂盒注意仍在规定储存条件下保存。
◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
实验前请准备好下列耗材与设备：
◆1.5mL或2mL无菌低吸附离心管
◆ 与PCR仪适配的96孔qPCR板或八联排管
◆ 1000μL，200μL，10μL无菌低吸附带滤芯枪头
◆ 荧光定量PCR仪
◆ 水浴锅/金属浴
◆ 离心机
◆ 震荡器
◆ 各规格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架
详见样品前处理试剂盒（货号为HG-CL100）操作说明书。
1. 定量参考品及NCS、NTC的制备
1.1 定量参考品：取出 PG13 DNA 定量参考品、DNA 稀释液置于冰上融化；待完i全融化后，轻微振荡混匀，瞬时离心；
1.2 取 7 支干净的 1.5mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6；
1.3 标准品稀释过程如下表
| 标准品代号 | 稀释体积 | 浓度(fg/μL) |
| ST0 | 10μL PG13 DNA定量参考品 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 106 |
| ST1 | 10μL ST0 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 105 |
| ST2 | 10μL ST1 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 104 |
| ST3 | 10μL ST2 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 103 |
| ST4 | 10μL ST3 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 102 |
| ST5 | 10μL ST4 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 101 |
| ST6 | 10μL ST5 + 90μL DNA 稀释液 | 3 × 100 |
1.4 NTC 的制备：100uL DNA 稀释液；
1.5 NCS 的制备：取 100uL DNA 稀释液与样品同时进行前处理，纯化洗脱后的产物即为 NCS；
1.6 加标回收 ERC：建议 90uL 样品 +10uL ST3，也可根据实际情况按照其他方式制备。
2. q-PCR 反应液的制备和加样
2.1 根据所需检测的标准样品和待测样品数量（一般做 3 个复孔），计算所需孔数：
反应孔数 =（6 个浓度梯度的标曲 +2 个阴性对照 NTC 和 NCS + 待测样品）×3
2.2 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR Mix 总量：
qPCR Mix=（反应孔数 +2 或 3）× 20μL（2 或 3 为操作损失量）
2.3 将所需试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按下表所示配制 qPCR Mix。
| 组分 | 单孔反应(μL) |
| 2x qPCR Buffer | 15 |
| PG13 Primer&Probe Mix | 5 |
| 总体积 | 20 |
qPCR Mix配制表
3. 将所需试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表4所示加样（总体积30μL）：
| 参考品 | 20μL qPCR Mix +10μL ST1/2/3/4/5/6 |
| 阴性对照 | 20μL qPCR Mix +10μL NTC/NCS |
| 待测样品 | 20μL qPCR Mix +10μL 待测样本 |
各反应孔加样示例
4.实验需使用qPCR实验专用的八联管或者96孔板进行反应，需去除反应体系中的气泡，并离心将液体离至管底准备反应。
5.反应孔排版示例
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | ST1 | ST1 | ST1 | S1 | S1 | S1 | ||||||
| B | ST2 | ST2 | ST2 | S2 | S2 | S2 | ||||||
| C | ST3 | ST3 | ST3 | S3 | S3 | S3 | ||||||
| D | ST4 | ST4 | ST4 | |||||||||
| E | ST5 | ST5 | ST5 | |||||||||
| F | ST6 | ST6 | ST6 | ERC -S1 | ERC -S1 | ERC -S1 | ||||||
| G | NTC | NTC | NTC | ERC -S2 | ERC -S2 | ERC -S2 | ||||||
| H | NCS | NCS | NCS | ERC -S3 | ERC -S3 | ERC -S3 |
96孔板排版示例
（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR仪为例。）
1.创建实验反应程序，设置两步法反应程序如下表：
| Stage1 | 预变性 | Reps:1 | 95℃ | 30s |
| Stage2 | 循环反应 | Reps:40 | 95℃ | 5s |
| 56℃ | 34s |
2.创建实验反应板，点击Select Fluorophores选择荧光FAM；在反应板图表中，选择样品孔，在Sample Type中下拉选择Unknow，勾选荧光FAM，Target Name命名为PG13-DNA；输入每个样品的重复次数及Sample Name。(备注：如仪器要求设置猝灭基团与参比荧光：猝灭基团为None，参比荧光为ROX。)
3.在反应板图表中，选择标曲孔，在Sample Type中下拉选择Standard，勾选荧光FAM，Target Name命名为PG13DNA；输入每个稀释梯度的重复次数及Sample Name。分别在ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6的Concentration一栏赋值为3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02、3.00E+01、3.00E+00（单位为fg/μL）。
4.点击Run界面“Start Run"按钮进行PCR测定。
以BIO-RAD公司CFX96 qPCR仪为例
1. 点击资料分析视窗Quantitation，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、扩增效率（Effect）、R2。
2. 在视窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一栏可读取无模板对照NTC、NCS、待测样本的检测值，单位为fg/μL。
3. 数据可靠性评估：
• 三个平行孔间Ct值差应小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 阴性对照NTC和NCS的CT值都应大于标曲最i低浓度的CT值或根据实验室自身验证结果设定标准；
• 标准曲线线性相关系数R2≥0.98，扩增效率85%~110%之间；
• ERC回收率在50%~150%之间（加标回收率=ERC/(0.9*样品+0.1*ST3)。
1. 本试剂盒已通过稳定性（冻融等因素）的验证，无需分装。
2. 阴性样品和阳性样品（参考品和待测样品等）的配制环境需区分区域，不可在一个区域内操作，配制人员需穿戴整齐，戴
好口罩、手套和穿好洁净服。
3. 注意在不同加样步骤间及时更换吸头，避免交叉污染，避免长时开盖。
4. 试剂盒必须在有效期内使用。
5. 试剂盒内所有组分建议在低温环境融化后使用。
6. 只有严格遵守说明书的操作方法，全部使用本试剂盒配套的试剂才能保证优良检测效果。
7. 尽量在当天完成样本前处理纯化后立即进行后续qPCR检测，以保证检测结果的准确性。
8. 最终的试验结果与试剂的有效性、操作者的操作方法及试验环境密切相关。
9. 公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，
预留充足的样本。
10. 本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断。
PG13 残留DNA检测试剂盒（qPCR荧光探针法）产品订购，请联系柏莱源（天津）生物科技有限公司！
柏莱源（天津）生物科技有限公司的优势：
现货供应：公司库存充足，可快速发货，减少用户等待时间。
效期保障：严格把控产品质量，确保试剂效期新鲜，保障实验结果的可靠性。
专业技术支持：提供详细的实验方案和技术指导，帮助用户优化实验条件，提高实验成功率。
定制化服务：根据用户需求，提供个性化的产品和服务解决方案。
售后保障：完善的售后服务体系，及时解决用户在使用过程中遇到的问题。
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