新年新氣象！珀羅汀生物成功建立高通量全長膜蛋白表達(dá)平臺，重磅推出“從核酸到蛋白"的膜蛋白整體化解決方案。
膜蛋白約占主要藥物靶點(diǎn)的50%。然而，由于跨膜結(jié)構(gòu)域具有高度疏水性，膜蛋白在表達(dá)和純化過程中不穩(wěn)定，易于聚集和沉淀。全長膜蛋白的重組表達(dá)與純化的難題，制約了膜蛋白靶向藥物的開發(fā)。
（來源Ai圖）
無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（Cell Free Protein Synthesis, CFPS）是一種無活細(xì)胞參與、高開放性、高可控性的體外蛋白質(zhì)生物合成技術(shù)。
通過加入去垢劑或納米盤的方式，無細(xì)胞表達(dá)體系可以為膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域提供疏水環(huán)境，減少膜蛋白的錯誤折疊，實(shí)現(xiàn)全長跨膜蛋白可溶表達(dá)。CFPS所獲得的全長跨膜蛋白穩(wěn)定性更高、更接近天然構(gòu)象。
圖1 CFPS表達(dá)全長跨膜蛋白示意圖[1]
珀羅汀生物基于自主知識產(chǎn)權(quán)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)，已成功表達(dá)多種單次、四次、七次全長跨膜蛋白，表達(dá)成功率接近100%！
案例展示：
珀羅汀生物基于自主知識產(chǎn)權(quán)的無細(xì)胞表達(dá)體系，結(jié)合高通量無細(xì)胞蛋白表達(dá)工作站，現(xiàn)已成功建立商業(yè)化的高通量全長膜蛋白表達(dá)平臺，推出“從核酸到蛋白"的膜蛋白整體化解決方案。
Step 1：去垢劑條件測試
不同去垢劑對各種膜蛋白的作用有所區(qū)別，因此在膜蛋白的分離與純化過程中需要有針對性地選用合適的、一定濃度的去垢劑。
首先，構(gòu)建目的基因融合GFP的線性化表達(dá)模板，在含不同種類、不同濃度去垢劑的無細(xì)胞體系中進(jìn)行表達(dá)測試，通過GFP熒光強(qiáng)度判定目的蛋白表達(dá)效果，快速優(yōu)選3種去垢劑條件。
依托珀羅汀生物攜手玄刃科技打造的高通量無細(xì)胞蛋白表達(dá)工作站，可以實(shí)現(xiàn)高通量、自動化膜蛋白表達(dá)。在1 h內(nèi)完成數(shù)百個無細(xì)胞反應(yīng)體系自動構(gòu)建，8 h內(nèi)完成數(shù)百個膜蛋白去垢劑條件篩選。
Step 2：表達(dá)條件確定
在優(yōu)選的3種去垢劑體系中，進(jìn)一步篩選最適表達(dá)溫度，獲得一種最適表達(dá)條件。
Step 3：大量表達(dá)純化
確定表達(dá)條件后，構(gòu)建無細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒（不含GFP），根據(jù)蛋白需求量不同，采用毫升級或百毫升級無細(xì)胞反應(yīng)生產(chǎn)膜蛋白。通過親和層析等純化方式，可獲得純度~80%的全長跨膜蛋白。
核心優(yōu)勢
1. 膜蛋白全長表達(dá)（包含跨膜結(jié)構(gòu)域），接近膜蛋白天然構(gòu)象，能夠解決膜蛋白構(gòu)象不穩(wěn)定、易于沉淀或聚集、難分離純化等難題，且所表達(dá)膜蛋白具有生物學(xué)活性。
2. 高自動化水平。搭配高通量無細(xì)胞蛋白表達(dá)工作站，可以實(shí)現(xiàn)“從核酸到蛋白"的自動化蛋白表達(dá)，無需人工操作，建立蛋白表達(dá)的“黑燈工廠"。
3. 高表達(dá)通量。搭配高通量無細(xì)胞蛋白表達(dá)工作站，一天內(nèi)可完成數(shù)百至數(shù)千個無細(xì)胞表達(dá)反應(yīng)，獲得成百上千個蛋白。
4. 無需膜蛋白提取等復(fù)雜操作。膜蛋白在上清中可溶表達(dá)，可以直接用于下游活性檢測，無需常規(guī)蛋白表達(dá)所需的細(xì)胞裂解、膜蛋白提取等復(fù)雜操作。
5. 反應(yīng)體系可以線性化放大，從50微升到升級別。
6. 可選納米盤（Nanodisc）體系。珀羅汀CFPS所獲得的膜蛋白，允許從去垢劑體系置換至Nanodisc體系，可直接用于ELISA等下游檢測。
未來，珀羅汀高通量膜蛋白表達(dá)平臺還將推出Nanodisc表達(dá)體系，使表達(dá)出的膜蛋白直接插入Nanodisc，獲得穩(wěn)定性更高的膜蛋白！
讓天下沒有難表達(dá)的蛋白！
參考文獻(xiàn)：
[1]Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023 Jul;48(7):642-654.
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