如何利用CD分析蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹

dànbáizhì熱穩(wěn)定性是衡量其結(jié)構(gòu)完整性與功能保持能力的關(guān)鍵指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、蛋白工程和生物藥開發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域。圓二色譜（Circular Dichroism, CD）是一種敏感、快速且低樣本量的光譜技術(shù)，常用于分析dànbáizhì二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，特別適合評(píng)估熱變性行為和熔點(diǎn)（Tm）等熱穩(wěn)定性參數(shù)。

一、CD技術(shù)在dànbáizhì熱穩(wěn)定性分析中的作用

圓二色譜是依賴手性分子對(duì)左右旋圓偏振光吸收差異的光譜技術(shù)。對(duì)于dànbáizhì而言，其二級(jí)結(jié)構(gòu)（如α-螺旋、β-折疊）會(huì)在190–250nm的遠(yuǎn)紫外區(qū)域產(chǎn)生特征性CD信號(hào)。例如，α-螺旋通常在208nm與222nm附近顯示雙重負(fù)峰，而β-折疊結(jié)構(gòu)在216nm左右表現(xiàn)為負(fù)峰。當(dāng)溫度升高導(dǎo)致dànbáizhì發(fā)生熱變性時(shí)，其原有的有序結(jié)構(gòu)被破壞，CD光譜的特征信號(hào)會(huì)發(fā)生顯著變化。因此，通過監(jiān)測(cè)不同溫度下蛋白的CD信號(hào)，尤其是222nm處橢圓率值的變化，可jīngquè描繪蛋白熱解構(gòu)過程，進(jìn)一步計(jì)算熔點(diǎn)Tm值，反映其熱穩(wěn)定性。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作關(guān)鍵點(diǎn)

為獲得可靠的CD熱變性數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要充分考慮樣品特性、緩沖體系、波長(zhǎng)選擇與升溫條件等多重因素。

1、蛋白樣品制備

樣品純度和均一性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。推薦使用純度＞90%的dànbáizhì，避免聚集體或多態(tài)性干擾。緩沖液應(yīng)具備良好的熱穩(wěn)定性和低紫外吸收，常用如PBS、HEPES等，避免使用Tris等溫度敏感緩沖液。蛋白濃度一般控制在0.1–0.5mg/mL，確保獲得良好的信噪比。

2、波長(zhǎng)選擇

熱變性實(shí)驗(yàn)通常選擇222nm作為主要監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)，因其對(duì)α-螺旋結(jié)構(gòu)變化zuì敏感。對(duì)β-折疊結(jié)構(gòu)豐富的蛋白，也可關(guān)注216nm波長(zhǎng)處的變化。完整的遠(yuǎn)紫外CD光譜（190–250nm）可用于變性前后結(jié)構(gòu)比較，輔助判斷變性過程的方向與程度。

3、溫度范圍與升溫速率

溫度通常從10°C起，逐漸升高至90–95°C，具體依據(jù)dànbáizhì的預(yù)期穩(wěn)定性設(shè)定。升溫速率建議控制在0.5–1°C/min，保證系統(tǒng)熱平衡，避免數(shù)據(jù)偏差。每隔1–2°C記錄一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，可描繪出平滑的溫度-橢圓率曲線。

4、可逆性測(cè)試

在部分研究場(chǎng)景中，評(píng)估蛋白變性過程是否可逆具有重要意義?？稍谕瓿缮郎貟呙韬?，將樣品緩慢冷卻至初始溫度，再重新采集CD光譜，與加熱前光譜比較。若結(jié)構(gòu)能夠恢復(fù)，說明變性過程具有一定可逆性，適用于構(gòu)象可恢復(fù)的天然蛋白或某些工程蛋白設(shè)計(jì)的評(píng)價(jià)。

三、數(shù)據(jù)解讀與Tm計(jì)算方法

CD熱變性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通常表現(xiàn)為典型的S型曲線：初始階段蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，橢圓率信號(hào)保持恒定；隨著溫度升高，蛋白逐步解構(gòu)，橢圓率急劇下降；zuì終趨于平臺(tái)，代表wánquán變性狀態(tài)。

Tm值提取

Tm值是熱穩(wěn)定性分析的核心參數(shù)，表示dànbáizhì失去一半有序結(jié)構(gòu)的溫度。常采用雙態(tài)轉(zhuǎn)變模型（two-state transition model）對(duì)熱變性曲線進(jìn)行非線性擬合，假設(shè)蛋白在“天然態(tài)"與“變性態(tài)"之間直接轉(zhuǎn)化。通過擬合可準(zhǔn)確獲得Tm值及協(xié)同性參數(shù)，量化熱變性過程。對(duì)于多結(jié)構(gòu)域或多穩(wěn)定態(tài)蛋白，變性過程可能涉及多個(gè)Tm，需根據(jù)曲線形態(tài)與波峰/拐點(diǎn)位置綜合判斷，或輔以多波長(zhǎng)分析提高解析能力。

四、實(shí)驗(yàn)中常見問題及優(yōu)化建議

1、信號(hào)波動(dòng)或曲線不連續(xù)

可能由緩沖液干擾、蛋白聚集或氣泡引起。應(yīng)確保緩沖液經(jīng)脫氣處理、使用匹配的石英比色皿，并在樣品制備后短時(shí)間內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。

2、Tm值重復(fù)性差

需檢查升溫系統(tǒng)穩(wěn)定性、樣品是否降解或緩沖系統(tǒng)是否失效。建議每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試至少3次，確認(rèn)Tm值具有統(tǒng)計(jì)意義。

3、解構(gòu)不wánquán或無明顯轉(zhuǎn)變

可能是dànbáizhì極度穩(wěn)定，Tm超出檢測(cè)上限；也可能蛋白本身構(gòu)象柔性高，熱誘導(dǎo)不顯著。此時(shí)可嘗試延長(zhǎng)升溫范圍、調(diào)節(jié)緩沖環(huán)境，或考慮聯(lián)合化學(xué)變性策略如尿素誘導(dǎo)。

圓二色譜技術(shù)作為dànbáizhì熱穩(wěn)定性研究的重要工具，因其對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)敏感、操作簡(jiǎn)便、樣品消耗低等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于天然dànbáizhì、重組蛋白及突變體構(gòu)象穩(wěn)定性的評(píng)估。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件與數(shù)據(jù)分析方法，科研人員可快速、jīngzhǔn地獲取Tm等關(guān)鍵參數(shù)，從而為dànbáizhì功能機(jī)制解析、工程優(yōu)化與藥物研發(fā)提供強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支持。在CD分析及蛋白穩(wěn)定性研究領(lǐng)域，百泰派克生物科技憑借先進(jìn)的儀器平臺(tái)和規(guī)范化實(shí)驗(yàn)流程，致力于為科研人員提供高質(zhì)量的dànbáizhì圓二色譜分析服務(wù)，助力您揭示蛋白構(gòu)象背后的生物學(xué)意義。

百泰派克生物科技特色項(xiàng)目

一、蛋白測(cè)序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測(cè)序系統(tǒng)對(duì)dànbáizhì序列進(jìn)行分析，提供基于質(zhì)譜的蛋白測(cè)序分析服務(wù)，包括對(duì)dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù)。對(duì)于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測(cè)序法的dànbáizhì從頭測(cè)序服務(wù)，對(duì)蛋白序列進(jìn)行分析。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1.采用目前世界上先進(jìn)的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實(shí)現(xiàn)對(duì)所測(cè)定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測(cè)定蛋白N端多達(dá) 70個(gè)氨基酸序列;

4.可測(cè)定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測(cè);

6.測(cè)序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學(xué)

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺(tái)結(jié)合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學(xué)、靶向dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù)。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù)，助力微量樣本蛋白組學(xué)、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1 .高通量定量蛋白分析:多對(duì)照組大規(guī)模實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標(biāo)記方法，適用于分析組織、細(xì)胞、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)度高;

4.可檢測(cè)較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學(xué)分析，分析更系統(tǒng)準(zhǔn)確。

三、單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析，采用金屬元素標(biāo)記物（通常是金屬元素標(biāo)記的特異抗體）標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部的分子，然后用流式細(xì)胞原理分離單個(gè)細(xì)胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個(gè)細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號(hào)分子表達(dá)量。

※服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

1.技術(shù)先進(jìn)，填補(bǔ)技術(shù)空白

采用金屬標(biāo)記抗體技術(shù)，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題?？稍趩渭?xì)胞層面上對(duì)多種指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行表征，百泰派克生物科技可做到同時(shí)檢測(cè)51個(gè)目標(biāo)蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細(xì)胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細(xì)胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個(gè)左右，而流式質(zhì)譜技術(shù)一次（單樣本）就可分析至少10^5的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了數(shù)量級(jí)的提高，且成本不高于單細(xì)胞RNAseq。

3.應(yīng)用前景大

①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細(xì)胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機(jī)制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標(biāo)簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會(huì)有新應(yīng)用方向。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達(dá)量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實(shí)現(xiàn)10,000個(gè)以上I型多肽和10,000個(gè)以上II型多肽的鑒定和識(shí)別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺(tái)進(jìn)行免疫肽組學(xué)分析，可從zuì小的樣品材料中進(jìn)行可重復(fù)的識(shí)別和定量。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標(biāo)。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，MALDI TOF，高效色譜分離技術(shù)，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù)，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測(cè)平臺(tái)

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測(cè)和項(xiàng)目驗(yàn)證等zhuānyè服務(wù)。公司實(shí)驗(yàn)室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則，通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認(rèn)證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設(shè)備定期計(jì)量/期間核查，軟件審計(jì)追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù)，支持新藥研發(fā)、藥物申報(bào)注冊(cè)和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測(cè)分析服務(wù)；

2.獲國家CNAS實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)；

3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細(xì)胞分析、單細(xì)胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等；

4.七大質(zhì)量控制檢測(cè)平臺(tái)，滿足您一站式服務(wù)需求；

5.服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

如何利用CD分析蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)服務(wù)詳情介紹