MRM（Multiple Reaction Monitoring，多反應(yīng)監(jiān)測）和PRM（Parallel Reaction Monitoring，平行反應(yīng)監(jiān)測）是兩種靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)路線。以下是進(jìn)行MRM/PRM定量蛋白組學(xué)分析的一般步驟：
一、樣品準(zhǔn)備
1.蛋白提?。簭募?xì)胞、組織或其他生物樣品中提取蛋白質(zhì)。
2.蛋白處理：可能包括蛋白還原、烷基化、酶切等步驟，以將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為適合質(zhì)譜分析的肽段。
二、MRM/PRM方法開發(fā)
1.目標(biāo)蛋白和肽段選擇：基于研究目的和已有信息，選擇需要定量的目標(biāo)蛋白和對應(yīng)的特異肽段。
2.同位素標(biāo)記：如需要絕對定量，可使用同位素標(biāo)記的目標(biāo)肽段作為內(nèi)參。
3.MRM/PRM方法建立：利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（QQQ）或高分辨質(zhì)譜儀（如Orbitrap系列），根據(jù)目標(biāo)肽段的特性，建立MRM或PRM方法。這包括確定母離子、碎裂離子、碰撞能量等參數(shù)。
三、質(zhì)譜分析
1.樣品進(jìn)樣：將處理好的樣品進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。
2.數(shù)據(jù)采集：在MRM模式下，質(zhì)譜儀會(huì)針對預(yù)設(shè)的母離子進(jìn)行篩選、碎裂，并采集選定MS/MS2離子的質(zhì)譜信號(hào)。在PRM模式下，則是對目標(biāo)肽段的母離子進(jìn)行碎裂，并采集二級(jí)質(zhì)譜中所有碎片信息。
四、數(shù)據(jù)分析
1.質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析：使用專門的數(shù)據(jù)分析軟件（如Skyline）對采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，提取目標(biāo)肽段的信號(hào)強(qiáng)度。
2.定量結(jié)果計(jì)算：根據(jù)同位素標(biāo)記肽段的信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算目標(biāo)蛋白的絕對定量結(jié)果；或根據(jù)目標(biāo)肽段與內(nèi)參肽段的信號(hào)強(qiáng)度比，計(jì)算相對定量結(jié)果。
3.生物信息學(xué)分析：對定量結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，如差異表達(dá)分析、功能注釋等。
五、結(jié)果驗(yàn)證與解釋
1.方法驗(yàn)證：通過對比已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或與其他定量方法（如Western Blot）的結(jié)果進(jìn)行對比，驗(yàn)證MRM/PRM方法的準(zhǔn)確性和可靠性。
2.結(jié)果解釋：結(jié)合研究背景和生物信息學(xué)分析結(jié)果，對定量結(jié)果進(jìn)行解釋和討論。
技術(shù)特點(diǎn)與應(yīng)用
MRM技術(shù)：
特點(diǎn)：檢測速度快、離子篩選能力強(qiáng)、儀器穩(wěn)定性好、定量準(zhǔn)確性高。
應(yīng)用：適合對特定小群目標(biāo)蛋白進(jìn)行大批量樣本的定量檢測，尤其是臨床大隊(duì)列樣本。
PRM技術(shù)：
特點(diǎn)：操作簡便、檢測成本低、可靶向監(jiān)測的離子數(shù)量多。
應(yīng)用：適合小批量樣本、較多目標(biāo)蛋白靶向定量檢測的實(shí)驗(yàn)需求。
MRM/PRM定量蛋白組學(xué)分析是一種高精準(zhǔn)度的蛋白定量鑒定技術(shù)，通過合理的樣品準(zhǔn)備、方法開發(fā)、質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果驗(yàn)證步驟，可以對復(fù)雜樣品中的多個(gè)目標(biāo)蛋白進(jìn)行精準(zhǔn)定量研究。
MRM/PRM定量蛋白組學(xué)分析實(shí)驗(yàn)流程
