豬肺炎支原體抗原(MP-Ag)ELISA試劑盒 定性常見樣本處理及要求：

【血清樣本】：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時或 4℃過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意事項：收集血液樣本應(yīng)避免溶血，因為紅細(xì)胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA實驗中將會出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外，樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因為細(xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

【血漿樣本】：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意事項：檢測前請仔細(xì)閱讀ELISA試劑盒說明書，查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。

【細(xì)胞培養(yǎng)物上清】：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

【樣品保存】：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

檢測原理：試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被肺炎支原體（MP）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），與CUT OFF值相比較，從而判定標(biāo)本中肺炎支原體抗原（MP-Ag）的存在與否。

豬肺炎支原體抗原(MP-Ag)ELISA試劑盒 定性組成及其配置：

操作步驟：

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置陰、陽性對照孔和樣本孔，陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照各50μL；

3.  待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加稀釋液40μL；

4.  隨后陰、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

ELISA試劑盒常見問題解答：

1. 問：96T可以檢測多少個樣本？48T可以檢測多少個樣本？

上海軒澤康生物解答：96T ELISA試劑盒可檢測90個樣本，留6個孔做標(biāo)準(zhǔn)曲線；48T ELISA試劑盒可檢測42個樣本。

2. 問：能否使用自己的稀釋液或者緩沖液？

上海軒澤康生物解答：每個試劑盒中都含有按配方配置的與特異性樣品種屬相配套的稀釋液，以確保待檢測的樣品被正確稀釋。具體請參看說明書

3. 問：ELISA檢測試劑盒空白對照是什么意思？

上海軒澤康生物答：不加樣本，不加稀釋液，不加酶標(biāo)試劑。其他都可以加。

4. 問：我是按照實驗步驟進(jìn)行測定的但是沒有任何信號，這是為什么？

上海軒澤康生物答： 對于使用HRP底物的比色測定，終止液的加入會使底物變色。而說明書推薦的波長就是最適波長。通過輕拍酶標(biāo)板的邊緣充分混合孔內(nèi)試劑，加入終止液時顏色由藍(lán)變黃。如果加終止液之前孔內(nèi)試劑沒有混合，則底物顏色變綠。也可能加入試劑的順序錯誤。加入底物溶液以后不要清洗酶標(biāo)板，在連續(xù)稀釋時確定已經(jīng)加入標(biāo)準(zhǔn)品。如果底物系統(tǒng)中有兩個成份必須混合均勻。同時需確保酶標(biāo)儀的使用和操作正確。確定試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品都正確配置并按照說明滴加無誤。