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45次【JD-ZJY1】山东竞道厂家携手共创,让每一刻都闪耀企业光辉!
样本采集与保存
采集:根据检测目的确定采样部位。若检测水稻种子,要确保种子无霉变、虫蛀,随机选取一定数量的种子,一般不少于 100 粒,以保证样本的代表性。对于水稻植株,可采集叶片,选取生长良好、无病虫害的叶片,用干净剪刀剪取适量,一般每份样本采集 1 - 2 克叶片。
保存:采集后的样本需及时处理。若不能立即处理,种子可置于干燥、阴凉处保存,避免受潮;叶片样本可放入自封袋中,排除空气后密封,放入冰箱冷藏(4℃左右),保存时间不宜超过 3 天,以防核酸降解。
样本研磨
设备选择:可使用研钵和研杵手动研磨,也可选用组织研磨仪等电动设备。手动研磨适合少量样本,操作简单但效率较低;组织研磨仪能同时处理多个样本,效率高且研磨效果均匀。
操作步骤:将样本放入研钵或研磨仪的研磨管中,加入适量的液氮(液氮可使样本迅速冷冻,便于研磨)。若用手动研钵,用研杵快速研磨样本,直至呈粉末状;若用组织研磨仪,设置合适的研磨时间和频率,一般研磨时间为 1 - 3 分钟,频率为 20 - 30 次/秒,研磨完成后样本也应呈均匀粉末状。
核酸提取
试剂选择:常用的核酸提取试剂有 CTAB 法试剂盒、磁珠法试剂盒等。CTAB 法试剂盒成本较低,但操作步骤相对复杂;磁珠法试剂盒操作简便、快速,且提取的核酸纯度较高。
操作流程:以 CTAB 法为例,将研磨好的样本粉末转移至离心管中,加入 CTAB 提取液,65℃水浴 30 - 60 分钟,期间不时颠倒混匀。水浴后加入氯仿 - 异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀,12000 rpm 离心 10 - 15 分钟。取上清液转移至新的离心管中,加入异丙醇,轻轻颠倒混匀,-20℃沉淀 30 分钟以上。12000 rpm 离心 10 分钟,弃上清,用 75%乙醇洗涤沉淀 2 次,晾干后加入适量的 TE 缓冲液溶解核酸。
核酸纯化与浓度测定
纯化:可使用乙醇沉淀、柱纯化等方法进一步纯化核酸。乙醇沉淀可去除残留的盐离子和小分子杂质;柱纯化则利用特定的吸附柱,能高效去除杂质,提高核酸的纯度。
浓度测定:使用紫外分光光度计测定核酸的浓度和纯度。一般核酸在 260 nm 处有最大吸收峰,通过测量 260 nm 和 280 nm 处的吸光度值,计算 A260/A280 的比值。比值在 1.8 - 2.0 之间说明核酸纯度较高,可用于后续检测。根据测定的浓度,将核酸稀释至合适的浓度,一般转基因水稻检测中核酸浓度控制在 10 - 100 ng/μL。
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