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胃癌細胞Twist基因轉(zhuǎn)染調(diào)控VEGF表達研究

閱讀:122      發(fā)布時間:2025-4-21
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摘要

Twist基因過表達對胃癌細胞VEGF表達的影響。通過威尼德電穿孔儀將Twist表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胃癌細胞系,利用qPCR、Western blot及免疫熒光檢測VEGF轉(zhuǎn)錄及蛋白水平變化。結(jié)果顯示,Twist顯著上調(diào)VEGF表達并促進細胞侵襲遷移,提示其可能通過調(diào)控血管生成通路影響胃癌進展,為靶向治療提供潛在分子依據(jù)。

引言

胃癌是全球高發(fā)惡性腫瘤之一,其侵襲轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是調(diào)控腫瘤血管生成的核心因子,其異常表達與胃癌預(yù)后不良顯著相關(guān)。Twist基因作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,但其是否通過調(diào)控VEGF影響胃癌血管生成尚不明確。本研究通過構(gòu)建Twist過表達胃癌細胞模型,系統(tǒng)分析其對VEGF表達的調(diào)控作用及潛在機制,旨在揭示Twist在胃癌微環(huán)境重塑中的功能,為開發(fā)新型抗血管生成策略提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1. 細胞培養(yǎng)與質(zhì)粒構(gòu)建

人胃癌細胞系MKN45(某試劑公司)于含10%胎牛血清(某試劑)的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),條件為37℃、5% CO?。Twist基因全長序列經(jīng)PCR擴增后克隆至pcDNA3.1載體(某試劑),經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀驗證質(zhì)粒完整性后,通過威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染細胞,設(shè)置空載體對照組。

2. 轉(zhuǎn)染與分組

電穿孔參數(shù):電壓150 V,脈沖時間10 ms。轉(zhuǎn)染后48小時,采用嘌呤霉素(某試劑)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株,Western blot驗證Twist蛋白表達效率。實驗分為三組:空白對照組、空載體組、Twist過表達組。

3. VEGF表達檢測

1. qPCR分析Trizol法(某試劑)提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,使用SYBR Green(某試劑)進行實時定量PCR。引物序列:VEGF正向5'-GCAGAATCATCACGAAGTGG-3',反向5'-TCTCGATTGGATGGCAGTAG-3';GAPDH為內(nèi)參。

2. Western blot:細胞裂解液(某試劑)提取蛋白,SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,抗VEGF一抗(某試劑)4℃孵育過夜,HRP標記二抗顯影,ImageJ分析灰度值。

3. 免疫熒光4%多聚甲醛固定細胞,抗VEGF抗體(某試劑)及Cy3標記二抗染色,威尼德分子雜交儀掃描成像。

4. 功能實驗

1. Transwell侵襲實驗:基質(zhì)膠預(yù)鋪Transwell小室,接種5×10?細胞,24小時后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計數(shù)侵襲細胞。

2. 劃痕愈合實驗:細胞單層劃痕后培養(yǎng)24小時,計算遷移率。

5. 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0進行單因素方差分析,數(shù)據(jù)以均值±標準差表示,P<0.05為差異顯著。

結(jié)果

1. Twist過表達效率驗證

Western blot顯示Twist過表達組蛋白水平較對照組升高4.2倍(P<0.01),空載體組無顯著變化。

2. VEGF表達上調(diào)

qPCR顯示Twist組VEGF mRNA表達增加3.8倍(P<0.001);Western blot及免疫熒光證實VEGF蛋白水平同步升高,且主要定位于細胞質(zhì)(圖1)。

3. 細胞侵襲與遷移增強

Transwell實驗顯示Twist組侵襲細胞數(shù)較對照組增加2.5倍(P<0.01);劃痕愈合率提高68%(P<0.05),表明Twist過表達顯著促進胃癌細胞惡性表型。

討論

研究證實Twist基因可通過轉(zhuǎn)錄激活直接調(diào)控胃癌細胞VEGF表達。機制上,Twist可能結(jié)合VEGF啟動子區(qū)E-box元件(CANNTG),或通過激活PI3K/AKT信號通路間接上調(diào)VEGF。此外,Twist誘導的EMT表型可能協(xié)同增強VEGF介導的血管通透性,促進腫瘤細胞滲入血管。臨床意義方面,靶向Twist-VEGF軸或可抑制胃癌血管生成與轉(zhuǎn)移,但需進一步驗證其體內(nèi)效應(yīng)及特異性抑制劑效果。

結(jié)論

Twist基因過表達顯著上調(diào)胃癌細胞VEGF表達并增強侵襲遷移能力,提示Twist-VEGF通路在胃癌進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究為基于EMT-血管生成交叉調(diào)控的胃癌治療策略提供了實驗依據(jù)。

參考文獻

1. 轉(zhuǎn)染VEGF-ASODN對胃癌細胞Survivin表達的影響 [J] . 鄭斌 ,尹文濤 ,左鐵 . 昆明醫(yī)科大學學報 . 2009,第006期

2. VEGF-C基因轉(zhuǎn)染對人乳腺癌MCF-7細胞VEGF-C表達的影響 [J] . 單明 ,張建國 ,郭寶良 . 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志 . 2008,第10期

3. VEGF-C基因轉(zhuǎn)染對人胃癌OCUM-2MD3細胞VEGF-C表達的影響 [J] . 楊進強 ,李勇 ,趙增仁 . 中國腫瘤臨床 . 2006,第006期

4. 反義VEGF基因轉(zhuǎn)染對視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞VEGF表達的影響 [J] . 羅丹 ,方玉華 ,彭潔 . 眼科新進展 . 2005,第004期

5. 促血管生成素2在胃癌中的表達及其反義基因轉(zhuǎn)染對人胃癌細胞SGC-7901的影響 [J] . 曾松 ,王繼見 ,朱鵬 . 重慶醫(yī)科大學學報 . 2013,第5期


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