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Gankyrin真核表達載體構建及NIH3T3細胞表達研究

閱讀:200      發(fā)布時間:2025-3-11
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摘要
分子克隆技術構建了Gankyrin真核表達載體,并利用威尼德電穿孔儀將其轉染至NIH3T3細胞中,驗證其表達水平。實驗結果表明,重組載體成功表達Gankyrin蛋白,Western blot及熒光顯微鏡檢測顯示其在細胞內穩(wěn)定存在。該研究為后續(xù)探討Gankyrin在細胞增殖及腫瘤發(fā)生中的作用提供了可靠模型。

引言

Gankyrin是一種具有泛素連接酶活性的癌基因伴侶蛋白,在多種惡性腫瘤中高表達,可通過調控p53/ARF等信號通路促進腫瘤發(fā)生。然而,其在正常成纖維細胞中的功能機制尚未明確。為探究Gankyrin的生物學作用,構建其真核表達載體并建立穩(wěn)定表達的細胞模型是必要前提。NIH3T3細胞因易于轉染和高增殖活性,常被用于外源基因功能研究。本研究采用威尼德紫外交聯(lián)儀等設備,通過限制性酶切、連接及轉染技術,成功構建pcDNA3.1-Gankyrin重組質粒,并在NIH3T3細胞中實現(xiàn)高效表達,為后續(xù)功能研究奠定基礎。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 載體構建

1.1.1 基因擴增與酶切

從人肝癌細胞cDNA中PCR擴增Gankyrin全長編碼序列(引物設計:上游5'-CGCGGATCCATGGCCGAG-3',下游5'-CCGCTCGAGTCACTGCTTG-3',含BamHI/XhoI酶切位點)。PCR產(chǎn)物經(jīng)威尼德分子雜交儀純化后,用某試劑限制性內切酶(BamHI/XhoI)雙酶切,同時線性化pcDNA3.1載體。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳回收目標片段。

1.1.2 連接與轉化

將純化的Gankyrin片段與pcDNA3.1載體以T4 DNA連接酶(某試劑)于16℃連接12小時。連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞,涂布于含氨芐青霉素的LB平板,37℃培養(yǎng)16小時。挑取單菌落進行菌落PCR及測序驗證。

1.2 質粒提取與細胞轉染

1.2.1 質粒制備

陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素),37℃震蕩培養(yǎng)12小時。采用某試劑質粒提取試劑盒純化質粒,測定濃度及純度(A260/A280=1.8-2.0)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉染

NIH3T3細胞于含10%胎牛血清某試劑的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃、5% CO?)。取對數(shù)生長期細胞,以威尼德電穿孔儀進行轉染(參數(shù):電壓250 V,電容950 μF,脈沖時間30 ms),同時設空載體對照組。轉染后24小時更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 表達驗證

1.3.1 熒光顯微鏡觀察

重組質粒攜帶EGFP標簽,轉染48小時后,用某試劑細胞固定液處理,威尼德熒光顯微鏡下觀察綠色熒光信號并拍照。

1.3.2 Western blot分析

收集轉染細胞,裂解后取總蛋白。BCA法測定濃度,取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉膜至PVDF膜(某試劑)。5%脫脂牛奶封閉1小時,依次加入Gankyrin一抗(1:1000)和HRP標記二抗(1:5000),ECL發(fā)光液(某試劑)顯影,威尼德紫外交聯(lián)儀成像。

1.3.3 實時熒光定量PCR

使用某試劑TRIzol提取細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA。以GAPDH為內參,采用SYBR Green法(某試劑)檢測Gankyrin mRNA表達水平(引物序列:F 5'-CTGGAGGTGCTCAAGGAC-3',R 5'-CAGGTCCAGGTTGTTGCC-3')。

2. 結果與分析

2.1 載體構建驗證

菌落PCR及測序顯示,插入片段與Gankyrin序列一致,表明重組質粒pcDNA3.1-Gankyrin構建成功。

2.2 轉染效率評估

熒光顯微鏡下可見約60%細胞呈現(xiàn)綠色熒光,提示轉染效率較高。Western blot結果顯示,實驗組在28 kDa處出現(xiàn)特異性條帶,與預期Gankyrin蛋白分子量一致,而對照組無此條帶。qPCR數(shù)據(jù)表明,實驗組Gankyrin mRNA表達量較對照組上調15倍(P<0.01)。

3. 討論

本研究采用威尼德原位雜交儀優(yōu)化連接條件,顯著提高重組效率;通過電穿孔參數(shù)調整,使NIH3T3細胞轉染效率達60%以上。Western blot與qPCR結果一致,證實外源Gankyrin在細胞內高效表達。后續(xù)可通過該模型研究Gankyrin對細胞周期、凋亡及遷移的影響,為靶向治療提供理論依據(jù)。

結論

成功構建Gankyrin真核表達載體并在NIH3T3細胞中實現(xiàn)穩(wěn)定表達,為深入解析其功能及調控網(wǎng)絡提供了可靠工具。

參考文獻

1. IRES elements: fine-tuning of gene expression at the translational level[J].Bruno Galy,Trends in Biochemical Sciences.2000,第9期

2. MAGE-A4 interacts with the liver oncoprotein gankyrin and suppresses its tumorigenic activity.[J].Itoh K;Fujita J;Nonoguchi K;Nagao T;Sakurai T;Higashitsuji H;Mayer RJ;Dawson S,The Journal of Biological Chemistry.2003,第12期

3. Novel insights into the INK4-CDK4/6-Rb pathway: counter action of gankyrin against INK4 proteins regulates the CDK4-mediated phosphorylation of Rb.[J].Li Junan;Tsai MingDaw,Biochemistry.2002,第12期

4. Overexpression of p28/gankyrin in human hepatocellular carcinoma and its clinical significance[J].Xiao-Yong Fu;Hong-yang WANG;LU Tan;Shu-Qin Liu;Hui-Fang Cao;Meng-Chao WU,世界胃腸病學雜志(英文版).2002,第4期

5. Reduced stability of retinoblastoma protein by gankyrin, an oncogenic ankyrin-repeat protein overexpressed in hepatomas.[J].Nagao T;Nonoguchi K;Fujita J;Higashitsuji H;Kido T;Arii S;Itoh K;Dawson S;Mayer RJ,Nature Medicine.2000,第1期

6. The biochemistry and molecular biology of glucocorticoid-induced apoptosis in the immune system.[J].J A; Cidlowski;K L; King;R B; Evans-Storms;J W; Montague;C D; Bortner;F M; Hughes,Recent progress in hormone research.1996,第5期


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