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以6孔板細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染為例:
使用細(xì)胞培養(yǎng)液3ml，DNA質(zhì)粒3ug，PEI轉(zhuǎn)染試劑9ug?？梢愿鶕?jù)不同細(xì)胞特性，增加DNA和PEI使用量。
一、細(xì)胞培養(yǎng)
1. 轉(zhuǎn)染前24 h左右對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，接種密度約為1 - 3 × 105 cells/well。細(xì)胞接種密度，大約在60%左右。
2. 過(guò)夜培養(yǎng)。
3. 吸出培養(yǎng)液，使用新鮮培養(yǎng)液清洗3-4次。然后，加入2.7 ml新鮮配置的wanquan培養(yǎng)基。因?yàn)榧?xì)胞過(guò)夜生長(zhǎng)的分泌物有可能影響轉(zhuǎn)染效率，所有建議進(jìn)行細(xì)胞清洗操作。更換新鮮培養(yǎng)液，有助于轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞表達(dá)和生長(zhǎng)，防止細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的不足。
也可以不吸出培養(yǎng)液，不更換新鮮培養(yǎng)液，直接進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
4. 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到60% - 80%時(shí)，轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率。
二、PEI/DNA復(fù)合物配置
1. 在1.5 ml無(wú)菌離心管中加入150 μl opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入3 ug DNA質(zhì)粒，用移液器輕輕混勻。
2. 在1.5 ml無(wú)菌離心管中加入150 μl opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，并加入9 ug PEI轉(zhuǎn)染試劑儲(chǔ)存液，用移液器輕輕混勻。
3. 將PEI-opti-MEM滴加至DNA-opti-MEM中，用移液器輕輕混勻，室溫靜置15 - 30 min后可用于轉(zhuǎn)染。注意：形成的PEI/DNA復(fù)合物溶液盡量在30 min內(nèi)使用。
4. PEI/DNA復(fù)合物的形成，一定是分別在無(wú)血清培養(yǎng)基中稀釋后，再進(jìn)行混勻。血清的存在會(huì)干擾復(fù)合物的形成。
三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
1. 將PEI/DNA復(fù)合物混合液滴加至6孔板培養(yǎng)基中，輕輕晃動(dòng)吹打培養(yǎng)液使PEI/DNA復(fù)合物均勻分散。
2. 過(guò)夜培養(yǎng)24-72小時(shí)。
四、初始轉(zhuǎn)染條件
五、PEI轉(zhuǎn)染效率
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