超氧阴离子清除能力试剂盒说明书
微量法100T/96S
注 意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。
测定原理：
AP-TEMED系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成NO2－，NO2－与对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。
自备实验用品及仪器：
天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体1.5mL×1支，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加6mL蒸馏水充分溶解。
试剂三：液体7.5mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体7.5mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂五：液体7.5mL×1瓶，4℃避光保存。
样品处理
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体：直接检测。
4. 粉剂药物可配制成相同浓度，比如1mg/mL。
测定操作
对照管 | 测定管 | |
试剂一（μL） | 10 | 10 |
试剂二（μL） | 40 | 40 |
H2O（μL） | 25 | |
充分混匀，25℃反应1min | ||
样品（μL） | 25 | |
试剂三（μL） | 50 | 50 |
充分混匀，37℃反应30min | ||
试剂四（μL） | 50 | 50 |
试剂五（μL） | 50 | 50 |
充分混匀，37℃显色20min，于微量石英比色皿/96孔板，在530nm处测定对照管和测定管的吸光值，分别记为A对照管和A测定管。 | ||
注意：对照管只需测定一次。
计算公式：
超氧阴离子清除率 I%=
注意事项：
1. 试剂一4℃可保存2个月，配制好的试剂二4℃可保存一周，建议实验前配制，并尽快使用。
2. 样品处理完后立即进行测定，或者低温保存不超过24小时。
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