抗坏血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AAO）活性测定试剂盒说明书
微量法100T/96S
注 意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶"家族。细胞壁内的抗坏血酸和AAO与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通过质膜上的细胞色素b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。
测定原理：
AAO可直接氧化AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。
实验中所需仪器及设备：
低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2mL蒸馏水充分溶解。
粗酶液提取：
按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
AAO测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到265 nm。
2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。
3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL预热的试剂二和10μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。
AAO活性计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。
AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T
= 92.4×△A÷Cpr
(2). 按样本质量计算
AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。
AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T
= 92.4×△A÷W
ε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm； V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；
T：催化反应时间（min），2min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。
AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T
=184.8×△A÷Cpr
(2). 按样本质量计算
AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。
AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T
= 184.8×△A÷W
ε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104 L/mol/cm；d：96孔板光径（cm），0.5 cm； V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；
T：催化反应时间（min），2min。
注意事项:
配制好的试剂放在4℃保存，三天内使用完。
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