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糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b，GPb）试剂盒说明书

                                            微量法100管/48样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶a（GPa）和无活性的糖原磷酸化酶b（GPb）两种形式。GPb在一定浓度的腺苷酸（5^，-AMP）存在下可被激活。

测定原理：

GP催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH，在340nm下测定NADPH上升速率，即可反映GP活性。添加一定浓度的腺苷酸（5^，-AMP）时测定GP（GPa和GPb）活性，未添加腺苷酸（5^，-AMP）时测定GPa活性，GP活性－GPa活性得到GPb活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体16 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；

试剂五：粉剂×1支， -20℃保存；

样本的前处理：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；

2、  工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、  试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、  试剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

5、   试剂五的配制：临用前在试剂五管中加入500μL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保

6、   存，禁止反复冻融。

7、   将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于37℃预热5分钟；

8、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四、10μL蒸馏水和160μL工作液，立即混匀，记录340nm处5min后的A1和10min后的吸光值A2，计算ΔAGPa=A2-A1。

9、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四、10μL试剂五和160μL工作液，立即混匀，记录340nm处5min后的A3和10min后的吸光值A4，计算ΔAGP=A4-A3。

注意：由于每个样本需要同时测一个GP（GPa和GPb）活性和一个GPa活性，因此本试剂盒100管测48个样本。

GPb活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

b.用96孔板测定的计算公式如下：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

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