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葡萄糖-6-磷酸酶（G6P)试剂盒说明书

                                     微量法100管/96样

注   意 ：测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose 6 phosphatase，G6Pase，EC 3.1.3.9）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是糖异生过程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。

测定原理：

G6P催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖，变旋酶和葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NAD⁺还原生成NADH，在340nm下测定NADH生成速率，即可反映G6P活性。

需自备的仪器和用品：

分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体19 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂四：试剂×1支，-20℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

工作液的配制：临用前将试剂二、试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

2、   将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。

3、   在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL工作液，立即混匀，记录340nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：在该试剂盒中，若ΔA大于0.3，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于0.3可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

G6P活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）G6P活力计算

单位定义：每毫升血清（浆）每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

G6P（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷V样÷T=1608×ΔA

2、组织、细菌或细胞中G6P活力计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

G6P（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

G6P（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

G6P（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.215×ΔA

V反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）G6P活力计算

单位定义：每毫升血清（浆）每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

G6P（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷V样÷T=3216×ΔA

2、组织、细菌或细胞中G6P活力计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

G6P（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每g组织每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

G6P（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3216×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每1万个细胞或细胞每分钟生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

G6P（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=6.43×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

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