土壤中性蛋白酶（S-NPT）试剂盒说明书
微量法100管/48样
注 意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
土壤蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化，其水解产物是高等植物的氮源之一。S-NPT在中性环境下催化蛋白质水解，与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。
测定原理：
中性条件下，S-NPT可将酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。
实验中所需仪器及设备：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板、双蒸水
试剂组成和配置：
试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入6ml蒸馏水充分溶解；用不完的试剂4℃保存；
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入2mL试剂七，沸水浴加热溶解，然后加入8ml试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂4℃保存；
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入30ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存；
试剂五：液体8mL×1瓶，4℃保存；
试剂六：液体1.5mL×1支，0.05mg/ml标准酪氨酸溶液，4℃保存；
试剂七：液体5mL×1瓶，4℃保存；
样品处理：
新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。
测定操作：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。
2、样本测定：
试剂名称 | 测定管 | 对照管 |
风干土样（g） | 0.02 | 0.02 |
试剂一（μL） | 150 | |
试剂三（μL） | 150 |
混匀后，40℃水浴30min，振荡5-6次，使土样与反应液充分接触
试剂二（μL） | 50 | 50 |
混匀，8000g 25℃离心10min，取上清液，在EP管中加入下列试剂
测定管 | 对照管 | 标准管 | |
上清液（μL） | 60 | 60 | |
试剂六（μL） | 60 | ||
试剂四（μL） | 280 | 280 | 280 |
试剂五（μL） | 60 | 60 | 60 |
混匀，40℃水浴20min，8000g 25℃离心10min，取上清液200μL，680nm下读取各管吸光值A
注意：标准管只需测一次。每个测定管设一个对照管。
S-NPT活性计算：
单位定义：每天每g土样中产生1mg酪氨酸为一个 S-NPT活力单位。
S-NPT(mg/d/g土样)=C标准×(A测定管-A对照管)÷A标准管×V反总÷W÷T=24×(A测定管-A对照管)÷A标准管
C标准管：标准管浓度，0.05mg/mL；V反总：反应体系总体积，0.4mL；T：反应时间，30min=1/48d； W：样本质量，0.02g。
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