土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）试剂盒说明书
微量法100T/48S
注 意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
土壤亚硝酸还原酶是反硝化作用中的关键酶之一，参与亚硝酸盐至NO的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。
测定原理：
亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2—减少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。
需自备的仪器和用品：
天平、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。
试剂的组成和配制：
试剂一：液体4mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加4mL蒸馏水溶解。
试剂三：液体4mL×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）
试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）
试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。
工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。
样品处理：
新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。
测定操作表：
空白管 | 对照管 | 测定管 | |
风干土样（g） | 0.02 | 0.02 | |
蒸馏水（μL） | 40 | ||
试剂一（μL） | 40 | 40 | |
试剂二（μL） | 40 | 40 | 40 |
混匀后，25℃反应1h | |||
试剂三（μL） | 40 | 40 | 40 |
充分震荡30S，10000rpm，4℃，离心10min | |||
上清液（μL） | 70 | 70 | 70 |
工作液（μL） | 140 | 140 | 140 |
充分混匀，静置3min后测定540nm处吸光值，分别记为A空白管、A对照管、A测定管?？瞻坠苤灰鲆还埽扛霾舛ü苄枭枰桓龆哉展堋?/span> | |||
计算公式
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y = 1.5562x+ 0.0088，R2 = 0.996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。
酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO2ˉ 的量为一个酶活力单位。
S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷1.5562×V标÷W÷T
= 0.617×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W
T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04mL；W：样本质量，g。
b. 使用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y = 0.7781x+ 0.0088，R2 = 0.996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。
酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO2ˉ 的量为一个酶活力单位。
S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷0.7781×V标÷W÷T
= 1.234×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W
T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04mL； W：样本质量，g。
注意事项：
1. 配制好的工作液3天内使用完。
2. 若吸光值超过1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 严格控制显色时间，否则会对结果有影响。
4. 标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
5. A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-1.5。
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