土壤几丁质酶（Soil Chitinase，S-Chitinase）试剂盒说明书
微量法100T/48S
注 意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中，而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
测定原理：
几丁质酶水解几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与对二甲氨基苯甲醛产生红色化合物，在585nm处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器：
天平、水浴锅、离心机、震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板，甲苯、蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体4mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体65mL×1瓶，4℃避光保存。
样品处理：
新鲜土样风干，过30-50目筛。
测定操作表：
对照管 | 测定管 | |
土样（g） | 0.1 | 0.1 |
甲苯（μL） | 15 | 15 |
混匀，25℃静置15min | ||
蒸馏水（μL） | 100 | |
试剂一（μL） | 100 | |
混匀，37℃培养24h | ||
蒸馏水（μL） | 200 | 200 |
4000rpm，4℃，离心10min，取上清200μL于新的EP管中 | ||
试剂二（μL） | 20 | 20 |
混匀，沸水浴5min | ||
试剂三（μL） | 600 | 600 |
混匀，37℃显色20min，取200μL于微量石英比色皿/96孔板中，蒸馏水调零，测定585nm处吸光值，记为A对照管和A测定管，ΔA=A测定管-A对照管。 | ||
计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=5.2714x-0.0007，R2=0.9989；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值ΔA。
酶活性定义：37℃条件下，每克土壤每天分解几丁质产生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
土壤几丁质酶活性（μg/d/g 土样）=（ΔA +0.0007）÷5.2714×V反总÷W÷T×1000
= 598×（ΔA +0.0007）
V反总：反应体系总体积，0.315mL；W：样本质量，0.1g；T：反应时间，1d；1000：1mg/mL=1000μg/mL
b. 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=2.6357x-0.0007，R2=0.9989；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值ΔA。
酶活性定义：37℃条件下，每克土壤每天分解几丁质产生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
土壤几丁质酶活性（μg/d/g 土样）=（ΔA +0.0007）÷2.6357×V反总÷W÷T×1000
= 1195×（ΔA +0.0007）
V反总：反应体系总体积，0.315mL；W：样本质量，0.1g；T：反应时间，1d；1000：1mg/mL=1000μg/mL
注意事项：
试剂一充分混匀后再使用。
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