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3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase,PGK) 试剂盒说明书

阅读:455      发布时间:2023-09-19
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3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase,PGK

试剂盒说明书

                                                    微量法100T/96S

 

   正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶,广泛存在于动植物和微生物体内,催化1,3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸,产生1分子ATP,具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能,广泛应用于药物靶标设计。

 

测定原理:

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP,1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸,340nm处的吸光度变化反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

 

自备实验用品及仪器:

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板

 

试剂组成和配制:

提取液:液体100mL×2瓶,4℃保存。 

试剂一:液体10mL×1瓶,4℃避光保存。

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加2mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:粉剂×1支,-20℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四:粉剂×1支,-20℃避光保存。临用前加1 mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂五:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加4 mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

 

酶液提?。?/span>

PGK酶提取:建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4500g离心5min,取上清测定。

②胞浆和叶绿体PGK酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)1510的比例(建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液),冰浴匀浆后于4,500g离心5min,弃沉淀,取上清在4,8000g离心10min,取上清用于测定胞浆PGK酶活性,取沉淀加1mL提取液,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4,500g离心5min,取上清测定叶绿体中PGK酶活性。

建议测定总PGK酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的PGK,则按照步骤②提取粗酶液。

 

测定操作:

1.        分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2.        微量石英比色皿/96孔板,依次加入100μL试剂一,20μL试剂二,10μL试剂三,10μL试剂四,40μL试剂五,20μL粗酶液,充分混匀,记录340nm10s的吸光值A1310s的吸光值A2,△A=A1-A2

计算公式:

a.        用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

PGKnmol/min /mg prot)=ΔA÷ε×d×V反总÷(V×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每组织每分钟消耗1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

PGKnmol/min /g 鲜重)=ΔA÷ε×d×V反总÷(W ×V÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反总:反应体系总体积,0.2mL;εNADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,5 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g

 

b.       96孔板测定的计算公式如下

1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

PGKnmol/min /mg prot)=ΔA÷ε×d×V反总÷(V×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每组织每分钟消耗1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

PGKnmol/min /g 鲜重)=ΔA÷ε×d×V反总÷(W ×V÷V样总) ÷T=643.08×ΔA÷W

V反总:反应体系总体积,0.2mLεNADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g


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