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甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）试剂盒说明书

                                         微量法100管/96样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：                           

MCS广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶（CS）共同参与三羧酸循环的调节。

测定原理：

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在 412nm处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体20mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体1.5mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存，临用前加入1mL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①        称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②        将匀浆600g，4℃离心5min。

③        弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④        上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。

⑤        在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体CS测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）在试剂五中加入1mL无水乙醇和22mL试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、220μL试剂五和10μL试剂六，混匀，记录412nm处20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

MCS活性计算：

a.        使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V样÷V样总）÷T=177.8×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.3556×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

b.       使用96孔板测定的计算公式如下：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V样÷V样总）÷T=355.6×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.711×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

配方：

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存；（50mM Tris-HCl 7.4，8.56g 蔗糖，88mg EDTA）

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存；(10mM Tris-HCl 7.4，1％Trixton-100)

试剂三：液体1.5mL×1支，4℃保存；(100mM PMSF)

试剂四：液体×1瓶，4℃保存；（称0.135g Tris，0.166g KCl，8.4mgEDTA，溶于27.5mL双蒸水，用HCl调pH至7.5）

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；（称取2mg DTNB，2mg 丙二酰CoA于30mL试剂瓶）

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；（称取0.6mg草酰乙酸于1.5mLEP管）

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