亚洲精品综合日韩中文字幕网站_精品综合久久久久97_中文在线天堂网www_久久精品免费一区二区三区_91久久国产综合精品女同国语_久久资源总站在线国产成人

您好, 欢迎来到化工仪器网

| 注册| 产品展厅| 收藏该商铺

15021281375

Download

首页   >>   资料下载   >>   α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性测定试剂盒说明书

优利科(上海)生命科学有...

立即询价

您提交后,专属客服将第一时间为您服务

α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性测定试剂盒说明书

阅读:1189      发布时间:2023-06-11
分享:

α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性测定试剂盒说明书

                                        微量法100/96

 

   意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

α-KGDHEC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调控关键酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。

 

测定原理

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、 二氧化碳和 NADH,NADH340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制

试剂一:100mL×1瓶,-20保存;

试剂二:20mL×1瓶,-20保存;

试剂三:1.5mL×1支,-20保存;

试剂四:液体20mL×1瓶,4保存;

试剂五:粉剂×1瓶,-20保存;

试剂六:粉剂×1支,-20保存;

 

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、   称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、   将匀浆600g,4离心5min。

3、   弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4离心10min。

4、   上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH(此步可选做)。

5、   在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体α-KGDH活性测定。

 

测定步骤

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、  样本测定

1)在试剂五中加入18mL试剂四充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min现配现用;

2)在试剂六中加入1mL蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂六和180μL试剂五,混匀,立即记录340nm20s时的吸光值A1 2min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1

 

α-KGDH活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

 α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

2 按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

 α-KGDHnmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W× V÷V样总) ÷T=325×ΔA÷W

3 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.65×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 LεNADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

 

b.96孔板测定的计算公式如下

1 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:mg组织蛋白每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

2 按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性nmol/min/g 鲜重)[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W× V÷V样总) ÷T=650×ΔA÷W

3 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=1.3×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;εNADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

提供商

优利科(上海)生命科学有限公司

下载次数

29次

资料大小

130.5KB

资料类型

WORD 文档

资料图片

点击查看

浏览次数

1189次

产品展示

会员登录

请输入账号

请输入密码

=

请输验证码

收藏该商铺

标签:
保存成功

(空格分隔,最多3个,单个标签最多10个字符)

常用:

提示

您的留言已提交成功!我们将在第一时间回复您~
在线留言
太仓市| 城固县| 台南县| 当阳市| 金湖县| 梨树县| 宁海县| 兴安盟| 文化| 白玉县| 宁晋县| 北碚区| 林甸县| 孟连| 蓬莱市| 武义县| 德庆县| 华安县| 秦皇岛市| 凤翔县| 闽清县| 托里县| 当雄县| 宁乡县| 东方市| 晋江市| 五台县| 韶关市| 奉新县| 昭平县| 望城县| 陆丰市| 夹江县| 嘉善县| 凤山县| 保山市| 成都市| 青岛市| 张家界市| 高清| 苍山县|