细胞壁不溶性酸性转化酶（cell-wall binding acid invertase, B-AI）试剂盒说明书
微量法100管/48样
注 意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH，Ivr分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。
AI的最适pH为3～5。AI分为可溶性AI(S-AI)和细胞壁不溶性AI（B-AI）两种类型。B-AI存在于细胞间隙并结合在细胞壁上，主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解，以维持库源之间蔗糖的浓度。
测定原理：
B-AI催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在510nm有特征光吸收，在一定范围内510nm光吸收增加速率与B-AI活性成正比。
自备用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液1：液体100mL×1瓶，4℃保存;
提取液2：液体100mL×1瓶，4℃保存;
试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存;
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10mL试剂一充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存;
试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存；
粗酶液提?。?/span>
按照组织质量（g）：提取液1体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液1），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心10min，弃上清，沉淀中加入1mL蒸馏水，充分震荡混匀，12000g 4℃离心10min，弃上清，沉淀中加入1mL提取液2 充分混匀，4℃浸提过夜，12000g 4℃离心20min，取上清置冰上待测。
测定步骤和加样表：
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至510nm，蒸馏水调零。
2、样本测定，（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
样本 | 50 | 50 |
试剂一 | 200 | |
试剂二 | 200 |
混匀， 37℃准确水浴30min后，95℃水浴10min（盖紧，以防水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变）
试剂三 | 125 | 125 |
混匀，95℃水浴10min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中， 510nm处记录各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)，ΔA=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。
B-AI活性计算：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y = 0.0016x -0.001；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。
（1）按蛋白浓度计算：
单位的定义：37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
B-AI活性（μg /min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr
（2）按鲜重计算：
单位的定义：37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
B-AI活性（μg /min /g鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W
V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准条件下测定的回归方程为y = 0.0008x -0.001；x为标准品浓度（μg/mL），y为吸光值。
（1）按蛋白浓度计算：
单位的定义：37℃每mg蛋白每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
B-AI活性（μg /min /mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr
（2）按鲜重计算：
单位的定义：37℃每g组织每分钟产生1μg还原糖定义为一个酶活性单位。
B-AI活性（μg /min /g鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W
V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
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