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亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）试剂盒说明书

 微量法100T/48S

注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

测定原理：

亚硝酸还原酶可将NO₂^—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO₂^—减少，即540nm处吸光值的变化可反映亚硝酸还原酶的活性。

需自备的仪器和用品：天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。

试剂的组成和配制：

提取液：液体112mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体4mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加5mL蒸馏水溶解。

试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）

试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）  

试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。

酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2．细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

测定操作表：

计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 1.3594x + 0.0072，R² = 0.9997；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。

1．按照蛋白含量计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（V样×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/g 鲜重）=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（W ×V样÷V样总）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷W

3. 按照细胞数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细胞每小时还原1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h /10⁴ cell）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T = 1.47×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷细胞数量

V标：标准液体积，0.04mL；V样：体系中加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g

b. 使用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.6797x + 0.0072，R² = 0.9997；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A标准管-A空白管）。

1．按照蛋白含量计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷（V样×Cpr）÷T = 2.94×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h/g 鲜重）=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷（W ×V样÷V样总）÷T = 2.94×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷W

3. 按照细胞数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细胞每小时还原1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（μmol/h /10⁴ cell）= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T = 2.94×（A空白管-A测定管+A对照管-0.0072）÷ 细胞数量

V标：标准液体积，0.04mL；V样：体系中加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g

注意事项：

1.        配制好的工作液3天内使用完。

2.        若吸光值超过1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3.        严格控制显色时间，否则会对结果有影响。

4.        标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。

5.        A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-1.5。

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