胃蛋白酶（Pepsin）试剂盒说明书
微量法100T/48S
注 意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
胃蛋白酶由胃粘膜主细胞分泌，分解食物中蛋白质成小肽段。一般用于神经性低酸症的鉴别，慢性胃炎、慢性胃扩张、慢性十二指肠炎等症状时也会引起胃蛋白酶分泌的减少。
测定原理：
胃蛋白酶可催化血红蛋白水解，水解产物与福林试剂反应后显蓝色；一定范围内，其颜色的深浅与胃蛋白酶活性呈正比。
自备仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10mL试剂二充分溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入10mL蒸馏水充分溶解。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入15mL蒸馏水充分溶解。
试剂六：液体3.3mL×1瓶，4℃保存。
标准品：液体1.27mL×1支，0.5μmol/mL酪氨酸标准溶液浓度4℃保存。
粗酶液提取：
组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
测定步骤：
1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到580 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三和试剂四置于37℃水浴预热30min。
3. 标准管：取微量玻璃比色皿/96孔板，加入20μL标准品，40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580 nm测光吸收，记为A标准管。
4. 空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板，加入20μL蒸馏水，40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，于 580 nm测光吸收，记为A标准空白管。
5. 对照管：取 EP管，加入100 μL蒸馏水，置于37℃水浴保温10min；加入100μL试剂四，盖紧后摇匀1min；加入20μL粗酶液，混匀后8000g 4℃离心10分钟取上清；在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL，再加入40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，于580 nm测光吸收，记为A空白管。
6. 测定管：取 EP管，加入20μL粗酶液，100μL试剂三，置于37℃水浴保温10min；加入100μL试剂四，
盖紧后摇匀1min；8000g 4℃离心10分钟取上清；在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL，再加入40μL试剂二，120μL试剂五，20μL试剂六，混匀后室温静置20min，于 580 nm测光吸收，记为A测定管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
计算公式：
a.使用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T
=27500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性（nmol/min/g 鲜重）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T
=27500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
C标准品：标准品浓度，0.5 μmol/mL酪氨酸；稀释倍数：（20+100+100）÷20=11；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10-2mL；W：组织质量（g）；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T
=27500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性（nmol/min/g 鲜重）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T
=27500×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
C标准品：标准品浓度，0.5 μmol/mL酪氨酸；稀释倍数：（20+100+100）÷20=11；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），20μL=2×10-2mL；W：组织质量（g）；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。
注意事项
试剂三、试剂四、试剂五临用前配制，配制好用不完的试剂4℃可保存一周。
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