羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）试剂盒说明书
微量法100T/96S
注 意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
测定原理：
样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯jia醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。
自备实验用品及仪器：
天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、无水乙醇、异丙醇、6mol/L盐酸和蒸馏水。
试剂组成和配制：
组织提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1，室温保存。
细胞提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
羟脯氨酸提?。?/span>
1. 组织：称取约0.2g样品于玻璃管，加入2mL的组织提取液，置于110℃烘箱，水解6至12小时，用提取液定容至2mL，12000g，25℃，离心20min，取上清待测。
2. 细胞：取约500万个细胞，加入1mL的细胞提取液，于高压消毒器中15磅保持30min，自然降压后待测。
3. 血清游离羟脯氨酸提取：取0.1mL血清，加入0.5mL无水乙醇使蛋白质沉淀，8000g4℃离心5min。将上清倒入另一个EP管，氮吹或沸水浴将乙醇挥发干。冷却后再加入0.2mL50%异丙醇，充分溶解混匀待测。
测定操作表：
1、 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至560nm，蒸馏水调零。
2、 操作表
对照管 | 测定管 | |
样本（µL） | 60 | |
试剂一（µL） | 60 | 60 |
混匀，室温静置20min | ||
试剂二（µL） | 60 | 60 |
H2O（µL） | 180 | 120 |
混匀，60℃，20min，取出后25℃静置15 min，取200µL于微量石英比色皿/96孔板中检测560nm处吸光值。ΔA=A测定-A对照 | ||
羟脯氨酸含量计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按样品重量计算
组织羟脯氨酸含量（mg/g 鲜重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反总÷(V样÷V样总×W)
= 0.154×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按细菌或细胞密度计算
细胞羟脯氨酸含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反总÷V样×V样总÷细胞数量（万个）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 细胞数量（万个）
（3）按血清体积计算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V反总÷V样×2
=0.154×（ΔA-0.0251）
V反总：反应总体积，0.3 mL；V样：反应中样品体积，0.06mL；V样总：加入提取液体积， mL；W：样本重量，g
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=32.4375x+ 0.0251，R2=0.9991
（1）按样品重量计算
HYP含量（mg/g 鲜重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反总÷(V样÷V样总×W)
= 0.308×（ΔA-0.0251）÷W
（2）按细菌或细胞密度计算
HYP含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反总÷V样×V样总÷细胞数量（万个）= 0.154×（ΔA-0.0251）÷细胞数量（万个）
（3）按血清体积计算
HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反总÷V样×2
= 0.308×（ΔA-0.0251）
V反总：反应总体积，0.3 mL；V样：反应中样品体积，0.06mL；V样总：加入提取液体积， mL；W：样本重量，g；2，血清吹干后复溶的倍数。
注意事项：
1、 吸光值大于0.8，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、 试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。
3、 Z低检出限为3.8mg/L。
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