产品及特点：
诺如病毒（Norwalk Virus）是单股正链 RNA 病毒，属于人类杯状病毒属，是一种引起非细菌性急性肠胃炎的病毒，如诺病毒感染性强，以肠道传播为主，通过口-粪传播，以污染的水源、食物、贝类、物品、空气作为主要传播载体。诺如病毒可分为 G I-G 五个基因群，其中引起人类感染的主要是 G1 和 G2 群。因此快速灵敏诊断具有重要意义。为此本公司开发了本产品，采用RT-PCR 技术检测疑似感染动物血清或组织中的诺如病毒 G2 型。它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
3. 产品精心优化且特异性高，引物是根据诺如病毒 G2 型RNA高度保守区设计，不会跟除此之外的其它病毒RNA发生交叉反应。
4. RT-PCR mix 中含上样染料，扩增反应后可以直接上样电泳。
5. 本产品足够50次20μL体系的PCR反应。
6. 本产品只能用于定性实验，不能用于定量。
7. 本产品只能用于科研。
规格及成分：
成 份 |
A |
B |
C |
D |
E |
使用手册 |
注：为避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的核酸片段作为阳性对照。
运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
自备试剂：样品RNA
使用方法：
一、样品DNA的制备
1. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取反应，多出的两个中一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）?？梢杂?span>10μL诺如病毒 G2 型PCR阳性对照（1×10E6拷贝/μL，本试剂盒提供）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）?？梢杂盟魑票傅囊跣远哉铡?/span>
2. 用自选方法纯化上述N+2个样品的DNA。本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。
二、设置PCR反应（20μL体系）
3. 标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的DNA样品，额外增加的两个管一个用于PCR阳性对照，另一个用于PCR阴性对照。按照下表在各PCR管中加入下列成分：
成分/每管 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照 | PCR阳性对照 |
A | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
D | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
制备的N+2个DNA样品 | 7 μL | - | - |
C | - | 7 μL | - |
E | - | - | 7 μL |
B | 1 μL | 1 μL | 1 μL |
4. 上机进行PCR，PCR反应参数为:
过程 | 温度 | 时间 |
逆转录 | 50℃ | 20 min |
预变性 | 95℃ | 10 min |
PCR反应 （45个循环） | 95℃ | 30 sec |
55℃ | 60 sec | |
72℃ | 60 sec | |
延伸 | 72℃ | 7 min |
三、电泳分析
1. 取5-10uL扩增产物进行常规琼脂糖电泳，检测扩增效果，由于扩增产物较短，建议用1.5%-2.0%的琼脂糖凝胶。
2. 阳性样品预期得到的扩增产物长度为220bp左右。如果两个阴性对照（样品制备阴性对照或PCR阴性对照）有此扩增产物，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析实验结果。
3. 如果所有样品和PCR阳性对照均无此扩增产物，则说明有系统性的问题（试剂、设备、程序、操作等），需要重复并排查原因。
4. 如果没有上述两种情况，则实验有效，可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中有扩增产物的判定为阳性，无则判定为阴性。
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