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應(yīng)用文集｜電荷異構(gòu)體分析“柱”力提高生物制藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性
本篇文集將會深入淺出介紹電荷異構(gòu)體分析，進而“柱"力提高生物藥行業(yè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性。
用于生物分子分析的離子交換(IEX)色譜
提高生物治療性藥物電荷變異體分析
蛋白質(zhì)由含有許多氨基酸的鏈組成，其中幾種氨基酸具有酸性或堿性側(cè)鏈基團。因此，蛋白質(zhì)表面上的總電荷可以通過調(diào)節(jié)周圍溶液的 pH 來控制。等電點 pI 是蛋白質(zhì)的凈電荷為中性時的 pH（正電荷數(shù)量等于負電荷數(shù)量）。如果 pH 低于 pI，則蛋白質(zhì)總電荷為正，可以保留在帶負電荷的陽離子交換吸附劑上；如果 pH 高于 pI，則蛋白質(zhì)總電荷為負，可以保留在陰離子交換吸附劑上。
圖 1. pH 值對蛋白質(zhì)凈電荷的影響
由于大多數(shù)蛋白質(zhì)所含的堿性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多數(shù)電荷異構(gòu)體分離需要采用陽離子交換。然而，每種蛋白質(zhì)都不相同，找到能夠?qū)崿F(xiàn)所需佳分辨率的條件可能需要相當(dāng)多的優(yōu)化工作。強陽離子交換柱通常更易于使用，但對于單克隆抗體，弱陽離子交換柱可能是實現(xiàn)所需分離度的唯一途徑。
在開始方法開發(fā)之前，確定目標蛋白質(zhì)的等電點 (pI) 是至關(guān)重要的。如果初始流動相條件的 pH 值過分接近蛋白質(zhì)的 pI，蛋白質(zhì)就不會保留在色譜柱上。pH 與主要物質(zhì)的等電點之間的差距應(yīng)為至少 0.5 至 2 個 pH 單位，具體取決于電荷異構(gòu)體 pI 的差異。蛋白質(zhì)可以通過鹽梯度（用高離子強度破壞蛋白質(zhì)在色譜柱上的吸附）或 pH 梯度（蛋白質(zhì)在 pH 等于 pI 時洗脫）洗脫。
圖 2. 陽離子交換的分離機制
基于離子電荷的分離通常在非變性條件下進行
離子交換是一種廣泛使用的方法，根據(jù)離子電荷的差異分離生物分子。它是一種溫和的非變性技術(shù)，不需要有機溶劑，因此經(jīng)常用于表征天然或活性形式的蛋白質(zhì)，也用于純化。
值得考慮采用一種能夠在方法開發(fā)過程中篩選幾種不同色譜柱的儀器。即使是離子強度和 pH 等方法條件的微小變化，也很難預(yù)測會產(chǎn)生怎樣的結(jié)果；這兩個因素都會影響蛋白質(zhì)上的凈電荷，如果是弱離子交換色譜柱，還會影響色譜柱上的凈電荷。建議采用嚴格的“質(zhì)量源于設(shè)計"方針。建議使用開發(fā)矩陣或系統(tǒng)化設(shè)計實驗的軟件。緩沖液顧問軟件可以利用 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色譜的四元 HPLC 泵功能，從而為方法開發(fā)節(jié)約大量時間。
因此，離子交換技術(shù)適用于分離具有不同等電點的蛋白質(zhì)，但它在分離單個蛋白質(zhì)的帶電異構(gòu)體方面同樣很有價值。在越來越重要的生物制藥領(lǐng)域，蛋白質(zhì)通過生物工程生產(chǎn)并從發(fā)酵反應(yīng)中分離出來，帶電異構(gòu)體表示著蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)存在差異，因此帶電異構(gòu)體的鑒定非常重要。一級結(jié)構(gòu)的差異可能說明糖基化或降解途徑有所變化，例如 C 端殘基缺失或酰胺化/脫酰胺化作用。它們還可能導(dǎo)致穩(wěn)定性或活性發(fā)生改變，并可能引起不良免疫反應(yīng)。離子交換用于在開發(fā)過程中分離和量化電荷異構(gòu)體，也用于生物治療藥物生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證。對于單克隆抗體 (mAb) 等大分子，還需要考慮分子的大小和結(jié)構(gòu)（mAb 通常為 150 kD），特別是當(dāng)色譜相互作用只會發(fā)生在表面電荷上時。
圖 3. 通過不同程度的氨基酸糖基化、脫酰胺化和氧化作用，以及重鏈的賴氨酸截短生成的單克隆抗體的電荷異構(gòu)體
Agilent Bio MAb HPLC 色譜柱
從內(nèi)到外的*性能
填料、涂層和鍵合能夠耐高壓，有助于實現(xiàn)更高的分離度和更快速的分離
親水聚合物層消除了大多數(shù)非特異性鍵合
高度均一、致密填裝的弱陽離子交換 (WCX) 功能團化學(xué)鍵合到親水聚合物層上
訂購信息
安捷倫色譜柱選擇 - 離子交換(IEX)
此外，本篇應(yīng)用文集中還包含利妥昔單抗創(chuàng)新藥物與生物仿制藥 mAb 的電荷異質(zhì)性分析、使用 4D-LC/MS 對單克隆抗體電荷異構(gòu)體進行全自動化表征等應(yīng)用簡報供您查閱。
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