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Lipofectamine ™ RNAiMAX轉染

時間:2024/4/23閱讀:1285
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轉染是實驗過程中常用的技術操作,通俗來說,常見的轉染即為把某種功能性質粒轉到細胞中去,通過轉染試劑的作用在經過一段時間后,收集細胞通過WB、qpcr等來檢測質粒是否正常發(fā)揮作用來達到我們實驗的某種需求;不同的質粒通常有不同的轉染試劑和不同的方法,如PEI轉染、lipo2000轉染等。

Lipofectmine ™ RNAiMAX轉染主要供siRNA和Stealth ™ RNAi 雙鏈體轉染使用,具有轉染效率高、對細胞毒性小等優(yōu)點,分為正向轉染及反向轉染兩種方式。siRNA轉染比較常見,因此本文分享主要針對siRNA反向轉染。


轉染前準備

1.準備試劑包括:Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA、不加雙抗的10%FBS培養(yǎng)基、胰酶、PBS緩沖液等常見處理細胞的試劑。

2.反向轉染要求細胞密度≥90%。

轉染中

1.按正常處理細胞的流程將長滿的細胞經過胰酶消化離心后去上清,注意此處需要加無雙抗的10%FBS培養(yǎng)基1ml進行細胞重懸,重懸完后根據(jù)細胞生長速度鋪細胞,保證轉染完后24h細胞密度達到30-50%。

2.轉染復合物制備:根據(jù)說明書制備轉染復合物,添加量如下表所示。

Lipofectamine ™ RNAiMAX轉染

根據(jù)轉染的實際情況將Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA依次加入到一個無菌Ep管中,按照先加Opti-MEM培養(yǎng)基、再加siRNA最后加Lipofectamine™ RNAiMAX試劑的順序,輕輕混勻室溫孵育20min。

3.20min后依次將轉染復合物加入細胞培養(yǎng)皿種,輕輕混勻,放入細胞培養(yǎng)箱內。

轉染后

1.轉染后24h內最好不要挪動細胞,也不要拿出在顯微鏡下觀察,期間也無需進行細胞換液

2.轉染后48h后,可拿出細胞觀察細胞形態(tài)有無變圓,肉眼觀察轉染效率,對于生長較慢的細胞,其表型可能會在72h內逐漸顯現(xiàn)。根據(jù)細胞生長情況可進行換液,注意此時需要換含雙抗的血清培養(yǎng)基。

3.在顯微鏡下觀察細胞形態(tài),若細胞變圓較為厲害,應在轉染后4天左右收細胞進行轉染效率測定,時間太久細胞太少的話檢測難度較大。

4.此種轉染方式最長可維持5-7天的基因敲除效果。

注意事項

1. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑在冰箱4℃保存,切記不能冷凍。

2. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑不宜在室溫放置過久,因此在制備轉染復合物前從冰箱拿出,加完后應立即放回4℃再進行后續(xù)操作。

3.轉染復合物制備完成后室溫孵育時間不得超過20min,因此建議將細胞鋪好板后十字混勻,暫放于細胞培養(yǎng)箱內,再進行轉染復合物的制備。

4.siRNA應于-80℃保存。

5.在處理細胞重懸時一定要使用無雙抗的10%FBS培養(yǎng)基,避免細胞死亡,如果在鋪板后還要進行細胞傳代也沒有影響,直接用上述混懸液傳代即可。

6. Lipofectamine ™ RNAiMAX轉染的兩種方式差別不是很大,主要區(qū)別在于正向轉染需要提前一天進行細胞鋪板,第二天直接加入轉染復合物,同時還需要在轉染后4-6h進行細胞換液。反向轉染速度比正向轉染更快,操作較為簡潔,因此更建議使用反向轉染。

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