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瓊脂糖凝膠電泳的常見問題&分析

時間:2024/2/29閱讀:1560
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(一)同樣大小的DNA一起跑電泳,怎么條帶不一樣大?

DNA條帶不一樣大,本質(zhì)上是DNA在凝膠中的遷移率不一樣,有的跑得快,有的慢,通常情況同樣大小的DNA,遷移率是一樣的,條帶位置也會一樣。

但遷移率也受很多因素影響,例如DNA的構(gòu)象。例如環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA,和同等大小的線性DNA(例如單位點酶切后的質(zhì)粒),前者的遷移率要高,表現(xiàn)出來就是看上去超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子量好像小一點。

(二)為什么有時候加大電泳的電壓,DNA會跑得快,但有時效果卻不明顯?

在較低電壓時,提高電壓,DNA的遷移率也會提高;但如果DNA分子量太大時,增加電壓后對DNA遷移率的提高其實不成比例,說白一點,就是有效果,但不明顯。

例如,當DNA分子量大于2Kb后,施加在電泳槽兩端的電壓不應該高于5V/cm,如果電泳槽長40cm,那么電壓不應該高于200V。

(三)瓊脂糖質(zhì)量對電泳效果有多大影響?

有時候,換了一個批次的瓊脂糖,或者更換了新的供應商的瓊脂糖后,同樣的樣品進行電泳,效果也會有差異。

最常見的一個原因在于,瓊脂糖本身的質(zhì)量也是影響電泳結(jié)果的一個因素。

瓊脂糖由大量的多糖組成,這些多糖會與硫酸鹽吸附,成為一種叫硫酸化多糖的東西。在電泳時,它會產(chǎn)生正電荷,并向陰極移動,也就是和DNA移動的方向相反。

最終,DNA移動的阻力就增加了。這種現(xiàn)象叫做瓊脂糖的電內(nèi)滲(EEO)。因此,采購低水平電內(nèi)滲的瓊脂糖能有效提高分離效果。

(四)電泳緩沖液對電泳效果有多大影響?

電泳時,電泳緩沖液是一種經(jīng)常需要更換的試劑。

最佳的狀態(tài),應該是,使用同一批次的電泳緩沖液母液進行1X電泳緩沖液的配置和對應檔次電泳的凝膠配置。因為只有這樣操作,才能保證整個離子緩沖環(huán)境是一致的。

有時我們會為了圖方便,長期使用一個批次的1X電泳緩沖液進行實驗,甚至到了母液都用完了,還在用之前那個批次的緩沖液進行實驗。這樣就會影響實驗效果了。

另外,常見的電泳緩沖液的使用錯誤,還包括,直接倒入自來水替代電泳緩沖液,或者直接使用10X或50X的母液當緩沖液進行電泳?!?/span>

前者因為緩沖體系內(nèi)缺乏足夠的離子,造成電導率很低,DNA遷移速度很慢,甚至是靜止了;而后者則因為電導率太高,造成整個緩沖液產(chǎn)熱太厲害,甚至連凝膠都融化了。

(五)低熔點瓊脂糖和普通瓊脂糖有什么區(qū)別?有什么用途?

制作瓊脂糖的原料通常是兩種海藻:Gelidium和Gracilaria。普通的瓊脂糖通??梢苑蛛x1~25Kb范圍的DNA片段,熔化溫度一般在85~90攝氏度,凝固溫度一般在40~42攝氏度。

對普通瓊脂糖進行固化劑1號修飾后,可以降低瓊脂糖的熔化溫度。有的熔化溫度甚至低至40~45攝氏度!

這么低的熔化溫度有什么意義和應用呢?答案是低熔點瓊脂糖主要應用于DNA的快速回收,想象一下,在比較低的溫度時,例如50~60攝氏度,低熔點的凝膠已經(jīng)熔化了,但這個溫度下DNA還是很穩(wěn)定,不會解鏈的。

因此,只需要進行簡單的處理和升溫就能實現(xiàn)DNA的回收,而且這種回收得到的DNA還能直接進行一些下游實驗,例如細菌轉(zhuǎn)化。

(六)電泳緩沖液就是TAE buffer嘛?還有其他嘛?有什么區(qū)別?

其實,瓊脂糖電泳緩沖液有幾種,分別是TAE、TBE和TPE,不過常用的一般是TAE。下面就來看看這三種緩沖液有什么區(qū)別。

相同點:大家都是為電泳提供一個離子緩沖環(huán)境。

不同點:組份不同,對應的緩沖能力不同,應用場景也略有不同。我們具體來看看。

TAE:Tris-乙酸鹽+EDTA緩沖液組成;緩沖能力最弱,如果長時間的電泳,則不適合。其中一個標志是長時間電泳后,凝膠的陽極一側(cè)會發(fā)生酸化,凝膠中的溴酚藍會從藍色變?yōu)辄S色。因此,TAE需要定期更換,才能保證電泳效果。

TBE: Tris-硼酸鹽+EDTA緩沖液組成;TPE:Tris-磷酸鹽+EDTA緩沖液組成;緩沖能力比TAE要高,DNA在后兩種緩沖液中的遷移速度較慢,適用于分離低分子量DNA的電泳實驗。

(七)上樣緩沖液是什么?有什么用?

在正式電泳開始之前,常使用上樣緩沖液(loading buffer)來與樣品DNA混合,這種緩沖液在電泳時有什么用呢?

Loading buffer在瓊脂糖凝膠電泳中的作用主要有三個:

01 它可以增加樣品的密度,確保DNA樣品可以均勻沉入上樣孔內(nèi);

02 Loading buffer含有顏色指示劑,除了幫助上樣時觀察樣品是否準確加入孔內(nèi)

03 這種顏色指示劑主要由溴酚藍和二甲苯藍FF組成,它們兩者在電泳中會按照固定的遷移速度移動,所以,我們還可以在電泳時通過Loading buffer幫助我們觀察條帶的遷移進度

(八)電泳條帶看起來像個微笑的表情是什么原因?

最常見的原因是因為上樣量太大了,常見的凝膠孔位的寬度是5mm,如果往里面加載的樣品超過0.5ug的話,就表明過量了。

最后,電泳時就會出現(xiàn)條帶兩側(cè)卷起彎曲(像微笑表情)、模糊不清、條帶拖尾的現(xiàn)象。DNA片段越大,這種現(xiàn)象會越明顯。

需要補充的一點是,并不是所有出現(xiàn)條帶拖尾的現(xiàn)象,都代表樣品量過載,也有可能是含有其他雜質(zhì)或樣品降解造成的。

(九)點樣孔內(nèi)出現(xiàn)很亮的條帶,且不動,是什么原因?

DNA分子在電壓的推動下,會向前移動,但如果其分子量非常大,體積也就會變得很大,以至于無法穿過瓊脂糖向前移動。


如果在基因組DNA提取后,樣本中含有蛋白質(zhì),那么就很可能出現(xiàn)這種現(xiàn)象。其原因在于基因組中有大量的組蛋白和DNA纏繞在一起,如果提取過程中去除不干凈,這些蛋白就會和DNA一起進入后續(xù)電泳中。


而蛋白在瓊脂糖電泳中,無疑是體積超標了,因此整個孔內(nèi)的DNA也無法移動出去。


以下,我們還整理了一些過往制作的關于瓊脂糖凝膠電泳的視頻,有的是實驗原理,有的是實驗操作,希望對你有幫助。

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