本文要點：作者開發(fā)了一款新型多肽CP，可靶向腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133，將其與近紅外熒光探針偶聯(lián)后（CP-IRT），該探針在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)了有效地腫瘤靶向，其腫瘤與正常組織的信噪比大于8，此外，得益于多肽的修飾，該探針可以在6小時內(nèi)被腎臟代謝87%。

基于配體-受體介導(dǎo)的分子識別腫瘤生物標(biāo)志物靶向探針在體內(nèi)成像、癌癥早期診斷和靶向治療方面越來越受到人們的關(guān)注，作為小分子界面配體，多肽具有細(xì)胞穿透性，低免疫原性，高生物相容性和易于合成的特點。如今，可以生產(chǎn)具有特定結(jié)合特性的肽，使其具有與多種靶標(biāo)（包括癌癥生物標(biāo)志物蛋白）的結(jié)合特性。與抗體相比，多肽可以提供相似的高親和力和選擇性，而無需復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，并且在較小的尺寸和更快地從體內(nèi)清除方面具有優(yōu)勢，多肽也可用于與抗體不兼容的有機溶劑中的化學(xué)反應(yīng)。研究表明，在NIR-II窗口（1000-1700 nm）中發(fā)射更長波長的熒光探針可以從減少的光散射中受益，從而可以使生物組織的成像深度更深。NIR-II熒光成像還受益于組織自發(fā)熒光的減少，在亞厘米成像深度具有高信噪比的情況下還可以提高空間分辨率。到目前為止，NIR-II熒光團已包括無機納米材料（碳納米管，量子點和稀土納米顆粒）以及聚合物或脂質(zhì)體包裹的疏水有機染料，這些納米探針缺乏快速排泄的能力?；诩{米粒子的NIR-II顯像劑大部分保留在肝臟和脾臟中，并通過糞便途徑緩慢排出，較長的保留時間導(dǎo)致了長期的安全隱患。基于以上，作者開發(fā)了一款新型肽CP(圖1a)用于靶向腫瘤標(biāo)志物CD133受體，與D-A-D型染料通過點擊化學(xué)偶聯(lián)后，可以快速通過腎臟排泄。

圖1：a）CP的化學(xué)結(jié)構(gòu)：b）對CD133進(jìn)行CP的SPRi檢測；c）CP配體和CD133受體的分子對接模擬示意圖；d）FITC標(biāo)記的CP（綠色通道）和PE標(biāo)記的CD133抗體（紅色通道）與HT-29細(xì)胞核指示劑Hoechst33342（藍(lán)色通道）共定位。

作者首先研究了探針的細(xì)胞成像性能。利用等離子體金芯片，作者驗證CP-IRT探針的CD133的靶向性，如圖2a所示，CD133陽性細(xì)胞系HT-29和U87MG細(xì)胞熒光均強于CD133陰性細(xì)胞系HEK293T，這表明CP-IRT探針對CD133的親和力較高，體外細(xì)胞成像進(jìn)一步證實了這個結(jié)論（如圖2b所示）。

圖2：a）等離子體金芯片法用于檢測CP-IRT的靶向性能；b）CP-IRT對CD133陽性細(xì)胞系HT-29和U87MG以及CD133陰性細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞成像實驗。

作者隨后進(jìn)行了動物體內(nèi)成像實驗。利用HT-29移植瘤小鼠模型，尾靜脈注射探針后，在初始階段便可以觀察到小鼠的血管（圖3a），在兩小時后，腫瘤/正常組織信噪比達(dá)到大（T/NT≈8.3），而不修飾靶向肽的Free-IRT探針則不能有效富集于腫瘤組織（圖3d），預(yù)先注射阻斷劑量的CP肽使得CD1333受體被飽和，隨后注射探針，同樣在兩小時成像時發(fā)現(xiàn)腫瘤的熒光信號降低，這說明CD133受體被飽和。

圖3：a）靜脈注射CP-IRT并在808 nm激光激發(fā)下，利用1200 nm長通濾光片對CD133+腫瘤小鼠在不同時間點進(jìn)行成像；b）荷瘤的C57BL/6小鼠的光學(xué)數(shù)碼照片，藍(lán)色邊框是NIRⅡ成像視圖；c）注射CP-IRT后2h整個小鼠體內(nèi)的熒光強度分布圖，包括肝臟和腫瘤；d）CP-IRT與Free IRT的T/NT信噪比隨時間變化的曲線；e）僅由CP肽阻斷后，對CP-IRT注射后第2h進(jìn)行NIR-II成像。

作者對探針的排泄行為進(jìn)行研究。在注射探針后，NIRⅡ成像顯示大多數(shù)探針由膀胱排泄，如圖4a所示，在第370s時膀胱顯示出熒光信號，在150s時可以觀察到小鼠兩個尿道的熒光信號（圖4b），從而實現(xiàn)了尿道無創(chuàng)成像，為未來研究動物尿道疾病提供了工具。作者對比了多肽偶聯(lián)探針與抗體偶聯(lián)探針的腎臟排泄性能。作者將CP-IRT的排泄行為與蛋白質(zhì)和抗體偶聯(lián)的IRT的排泄行為進(jìn)行了比較，相對于分子量約100 kDa的肽，抗體是大型的功能蛋白。作者發(fā)現(xiàn)IRT染料與抗體和較小的蛋白質(zhì)（如牛血清白蛋白（BSA））結(jié)合可導(dǎo)致肝臟高攝取而無腎臟排泄（圖4c）。動態(tài)光散射測量（圖4d）顯示CP-IRT尺寸約為5 nm（在腎臟排泄范圍內(nèi)），而BSA-IRT尺寸約為25 nm，遠(yuǎn)高于腎臟濾過界限。因此，具有小的有機NIR-II染料的多肽偶聯(lián)探針顯示出從主要器官中快速清除的優(yōu)勢，而沒有在RES系統(tǒng)中長期保留的問題，而這通常是用抗體染料探針或基于納米顆粒的熒光團所常見的。

圖4：a）靜脈注射CP-IRT后仰臥位小鼠的視頻速率NIR-II成像（1200 nm LP，200 ms）；b）注射CP-IRT后進(jìn)行高分辨尿道成像；c）靜脈內(nèi)注射蛋白結(jié)合型IRT后對仰臥位的小鼠的視頻速率NIR-II成像（1200 nm LP，200 ms）；d）IRT，CP-IRT和蛋白質(zhì)-IRT的動態(tài)光散射測量