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技術(shù)文章

穩(wěn)定細胞株構(gòu)建

閱讀:1173          發(fā)布時間:2021-3-1

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系(穩(wěn)定表達細胞株)指在細胞中持續(xù)穩(wěn)定表達特定基因或干擾特定基因表達。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細胞染色體上,使細胞長期穩(wěn)定表達該基因。穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株包括多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株和單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。慢病毒感染目的細胞后,通過抗性基因篩選得到的細胞株是多個細胞克隆的組合。單克隆細胞株是從多克隆細胞中經(jīng)細胞克隆挑選得到的,由一個細胞擴增得到的細胞株。單克隆細胞株性狀統(tǒng)一,傳代過程中細胞的基因表達保持穩(wěn)定。

       用轉(zhuǎn)染質(zhì)?;虿《厩秩镜姆椒▽?gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細胞,根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標志選用相應(yīng)的藥物進行篩選混合陽性克隆。在陽性混合克隆的基礎(chǔ)上,得到單細胞長出的陽性單克隆,繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。常用的真核表達載體的抗性標志物有嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)。

       篩選穩(wěn)定細胞株的兩種方法
       1、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,單克隆方法篩選穩(wěn)定細胞系
       對大多數(shù)細胞轉(zhuǎn)染效率較低。對于基因過表達,如果轉(zhuǎn)染效率達到40%,基因過表達尚可。但是對于基因干擾實驗,對轉(zhuǎn)染效率要求遠遠高于基因過表達,通常質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無法滿足。
       另外,質(zhì)粒游離于細胞質(zhì)中,很快降解,無法滿足較長時間的檢測項目;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合幾率極低,穩(wěn)定細胞株構(gòu)建耗時耗力,且得率很低,往往需要挑取單克隆株。
       2、病毒感染篩選穩(wěn)定細胞株
       病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效,是目前主流的穩(wěn)定細胞系篩選方法。用慢病毒制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株,由于其高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達、宿主范圍廣,感染效率高,且與細胞染色體整合而不發(fā)生基因重排,是制備穩(wěn)定細胞株的理想載體。
       穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株服務(wù)流程
      1、載體構(gòu)建:將外源基因構(gòu)建到合適的載體上,如需病毒轉(zhuǎn)染,則包裝病毒。
      2、篩選濃度測定:以 10-14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
      3、細胞接種:轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞,各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定。進行轉(zhuǎn)染當天細胞應(yīng)達到 60%-80% 覆蓋。
      4、細胞轉(zhuǎn)染:用構(gòu)建好的載體(或包裝好的病毒)轉(zhuǎn)染目的細胞。
      5、抗生素篩選。
      6、鑒定篩選結(jié)果。
     終交付
     1、病毒滴度檢測報告;穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株;
     2、結(jié)題報告,包括詳細的實驗流程,測序結(jié)果和峰圖、引物序列、載體圖譜和滴度測定報告和q-P

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