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番茄内标准Apx基因探针法qPCR试剂盒实验操作步骤
阅读：137 发布时间：2025-7-25番茄内标准Apx基因探针法qPCR试剂盒实验操作步骤
在完成反应体系配制后，将PCR管或96孔板短暂离心，确保液体集中于管底，避免气泡干扰。随后将反应板置于qPCR仪中，按照以下程序设置扩增条件：
1. 预变性阶段：95℃维持30秒，充分激活DNA聚合酶并打开模板二级结构；
2. 循环扩增阶段：95℃变性5秒，60℃退火/延伸30秒（根据引物Tm值可微调），重复40个循环；
3. 熔解曲线分析（可选）：从60℃缓慢升温至95℃，每0.5℃采集一次荧光信号，验证扩增特异性。
实验过程中需注意：
- 阴性对照：设置无模板对照（NTC）以排除污染风险；
- 重复孔：每个样本至少设3个技术重复，确保数据可靠性；
- 荧光通道选择：若使用探针法，需匹配仪器FAM/HEX等通道，避免信号串扰。
数据分析时，采用ΔΔCt法计算目标基因相对表达量。首先用内参基因（如Actin）Ct值校正样本间差异，再通过实验组与对照组的Ct差值比较获得表达倍数变化。若熔解曲线出现多峰或阴性对照出现扩增，需排查引物二聚体或污染问题。
为提高实验成功率，建议在正式实验前进行预实验优化退火温度及引物浓度。此外，试剂盒开封后需分装保存，避免反复冻融影响酶活性。通过严谨的操作流程和质控步骤，可确保番茄Apx基因表达分析的准确性和重复性。