使用G418篩選HEK-293T細胞的詳細步驟

1. 細胞培養(yǎng)：復蘇HEK-293T細胞，用合適的培養(yǎng)基（如DMEM高糖培養(yǎng)基，含 10%胎牛血清等）在37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達80%-90% 時進行傳代或轉(zhuǎn)染操作。

2. 確定G418篩選濃度：如客戶所做，在96孔板中接種細胞，設(shè)置 0 - 1100 μg/mL的G418濃度梯度，用CCK8 檢測培養(yǎng)24小時的細胞活性，繪制細胞活力圖，確定HEK-293T細胞的G418 最小致死量。

3. 轉(zhuǎn)染：將目的基因連接到pCDNA3.1載體上，使用合適的轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine 3000 ），按照試劑說明書將重組載體轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中，轉(zhuǎn)染6小時后換液。

4. 加藥篩選：轉(zhuǎn)染后1 - 2天，根據(jù)確定的最小致死量，加入適量G418進行篩選。可以先采用較低濃度篩選一輪，比如最小致死量的 1/2 - 2/3濃度，維持篩選2 - 3周，期間每2 - 3天換液并補充G418 。然后再用較高濃度（接近或等于最小致死量）進行第二輪篩選1 - 2周。

5. 單克隆挑選：待細胞形成單克隆后，用有限稀釋法或細胞克隆環(huán)將單克隆細胞挑選到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)后檢測目的基因的表達情況。

HEK-293T細胞篩選注意事項

1. 細胞狀態(tài)：確保用于轉(zhuǎn)染和篩選的HEK-293T細胞處于良好的生長狀態(tài)，細胞活力應在90% 以上，且無支原體等污染。

2. 轉(zhuǎn)染效率：優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，包括轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例、轉(zhuǎn)染時間等，以提高轉(zhuǎn)染效率。可設(shè)置不同轉(zhuǎn)染條件的對照組，確定優(yōu)良轉(zhuǎn)染方案。

3. G418質(zhì)量：G418的質(zhì)量對篩選結(jié)果影響較大，應選擇質(zhì)量可靠的產(chǎn)品，使用前檢查其效價和純度，溶解后過濾除菌，-20 ℃保存。

4. 篩選濃度：篩選濃度需根據(jù)細胞活力圖結(jié)果和實驗經(jīng)驗確定，濃度過低可能導致假陽性細胞過多，過高則可能殺死陽性細胞。

5. 換液頻率：篩選期間換液頻率不宜過高或過低，過高可能導致細胞生長受影響，過低可能使代謝廢物積累影響細胞狀態(tài)和篩選效果。

6. 無菌操作：整個篩選過程需嚴格遵守無菌操作規(guī)范，防止雜菌污染。

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