本发明公开了从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括：先对尿液样本进行冻干处理，再使用抽提试剂提取总外泌体，然后使用抗体标记磁珠吸附，分离纯化出肿瘤细胞来源的外泌体。本发明方法不仅克服了目前由于提取试剂盒只能提取少量尿液而无法达到大规模筛选或表达检测的实验要求的缺陷，实现了在尿液中获得可检测浓度的外泌体，而且，还克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，从而在尿液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物信息。本发明方法具有无创取样、特异性强、方便易行、价格低廉、且能直接用于后续检测的优势，具有较高的临床推广应用价值。