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生物打印123，如何选择生物墨水、细胞及生物打?。?/h3>
阅读：611 发布时间：2024-1-22
生物墨水类型概述
生物墨水是用于3D生物打印的生物材料。生物墨水的材料特性会影响其与细胞的相互作用及其作为生物打印结构的成功。理解生物打印中使用的各种材料的一种方法是按它们在打印过程中的角色对它们进行分类。给定的生物墨水可以是基质墨水、支撑墨水或牺牲墨水。
基质墨水
基质生物墨水保持和支持细胞，在生物打印中起着重要作用。大多数基质生物墨水是水凝胶，这意味着它们主要由水组成。目前市场上的生物墨水具有优势和劣势，通常满足生物打印所需的部分但不是全部要求。其他类别的试剂可以帮助弥补这些弱点。有关基质油墨的一些示例及其主要用途。
支撑墨水
支持生物墨水是生物相容性材料，比基质墨水具有更好的机械性能。通常使用支持油墨来支持生物打印结构，因为水凝胶往往柔软且结构完整性低。支持生物墨水也常用于结缔组织或硬组织应用，例如软骨、骨骼或肌肉组织的制造。有关支撑油墨及其使用条件的一些示例，请参见下表。
牺牲墨水
顾名思义，牺牲生物墨水被设计为作为临时支撑物沉积，然后在后处理中移除。它们通常用于创建复杂的负几何形状，例如血管网络。在某些情况下，它们还可以用于提高使用本身形状保真度较差的材料制成的打印件的分辨率。有关支撑油墨及其使用条件的一些示例，请参见下表。
支撑墨水
虽然支撑和牺牲生物墨水可以提供持续或临时的加固，但这无助于仅由软水凝胶或其他几何复杂组成的结构。像FRESH这样的方法涉及打印到支撑槽中，从而能够创建这样的结构。
近端小管 STL 文件（左）、FRESH 浆液中的生物打印小管（中）、FRESH 后处理的小管（右）
交联固化剂
通过将细胞封装在生物墨水中，细胞能够在活组织中生长和重塑生物打印结构。使用天然生物墨水可以帮助他们做到这一点，因为它含有天然蛋白质。蛋白质对不同的组织类型是不同的，并增加了生物墨水的特异性，使它们能够针对特定应用进行定制。玻连蛋白或纤连蛋白等蛋白质在体内用于调节细胞行为，如粘附、迁移、增殖和分化，并介导与胶原蛋白、肝素和GAG的相互作用。
光引发剂
光交联是增加基质油墨硬度的几种交联选项之一，这在某些结构中是可取的。特别是光交联利用电磁辐射中的能量来激活硬化过程。光引发剂是将必要的自由基引入基质生物墨水以允许光交联的物质。它们主要在可以激活它们的电磁频谱范围内有所不同。
3D模型指南
在3D打印之前，你必须知道这个物体是什么样子的。无论该对象是简单的测试圆柱体还是复杂的血管网络，您通常都从 3D 模型开始，将该模型转换为 STL 文件，然后将该 STL 文件转换为 G 代码文件，您的打印机会将其解释为电机运动。下面，我们将讨论如何将您的打印对象从想法转化为 STL。
自己设计
有许多程序可以让您自己设计 3D 模型。这些通常被称为CAD（计算机辅助设计）程序。SolidWorks、Inventor 和 AutoCAD 都是流行的选项，但您可以探索很多选项。设计自己的模型的主要优点是可以控制形状。将模型雕刻成您喜欢的规格后，您可以将 CAD 文件另存为 STL 文件，然后就可以继续切片了。
从医学影像转换
许多研究人员在开发 3D 模型时使用的另一种技术是将医学成像样本转换为 STL 文件。CT 扫描是常见的转换成像类型，但可以使用大多数形式，特别是如果它们可以保存为 DICOM（医学数字成像和通信）文件。转换由软件执行，该软件将成像样品中记录的光强度转换为相应的组织类型，并确定组织之间的边界。Mimics、3D Slicer 和 InVesalius 3 等程序都是流行的选择。转换医学成像结果的主要优点是所生成模型的临床相关性。
使用数据库
如果您无法访问临床成像样本，有许多数据库可供选择，其中包含 DICOM 衍生的 STL。许多学术机构都有自己的图书馆，并且存在提供许可协议的私人馆藏。您可以在下面找到数据库列表。
打印参数
3D生物打印中使用的每种材料都需要不同的设置，以获得的挤出和干净的线条。打印参数可以在微观层面上影响结果，例如细胞活力，以及宏观结果，例如孔径和结构保真度。下面我们将讨论使用Allevi生物打印机进行气动挤出生物打印工艺的关键参数。
切片参数
切片，或将 STL 转换为 G 代码文件的过程，需要不同的设置，告诉软件如何将 STL 划分为多个层，以及打印机如何移动以创建结构。这些设置包括层高、喷嘴大小和打印速度。一般来说，层高与喷嘴尺寸密切相关，因为喷嘴往往具有圆形横截面。需要注意的是，打印速度是指挤出机相对于打印表面的运动，而不是挤出材料的流速。材料属性（如粘度）的变化会导致不同的材料在不同的设置下表现更好。例如，有些材料非常粘稠，挤出速度很慢，需要较慢的打印速度才能匹配。
需要注意的是，打印生物材料分辨率的限制因素是针头的直径。随着层高的降低和打印速度的提高，分辨率通常也会提高。但是，喷嘴尺寸越大、层高越大、打印速度越慢，挤出就越容易。这些参数之间的平衡通常是打印优化的主题，下面将对此进行讨论。选择这些参数后，可以将 STL 切片为 G 代码。
填充物是指印刷品特征表面或外壳内的材料。在其他 3D 打印应用中，填充通常由几何形状和占用体积百分比定义。Allevi 系统允许您在所选填充图案中设置填充线之间的距离，从而更地控制终结构。您需要填充物的形状和数量将因构建体的目的和您使用的细胞系而异。
打印机参数
准备好 G 代码后，您仍然需要为您的材料输入正确的打印机设置。在 气动挤出平台中，这些因素包括压力、温度和交联。
随着时间的流逝，我们已经优化了一些适用于一些常见生物材料的参数。这些通用打印参数非常适合刚开始使用新材料，并作为进一步优化的起点。
针
针头特征（如规格、长度、轮廓和材料）会显著影响您可以使用的压力、温度和速度。虽然针头的通常很明显，但请使用我们的针头选择指南来权衡所有因素。
交联
交联是软网络分子改变其相互作用的过程，导致材料变硬。这可以通过下面进一步讨论的几种机制来实现。采用可用于光交联的 LED。用于热交联的加热床板?；Ы涣部梢越柚蛴』浼ㄈ缗嘌蠛屯岽蛴∨缱欤┙欣谩?/p>
优化
应用各不相同，终结构的目标规格也各不相同。也许您追求速度和高吞吐量，或者您更专注于精细分辨率。无论哪种方式，优化打印参数都是关键步骤。
基材
常见类型的打印基材
构建表面有三种基本类型：载玻片、培养皿和孔板。载玻片可用于将构建体移动到显微镜上进行成像。培养皿提供了一个非常简单的构建环境，适合大型构建和测试?？装逦觳馓峁┓奖愕姆盅?。每种类型的行业标准部件配合使用。事实上，Allevi 1 和 Allevi 3 平台中的自动校准功能经过编程，可以补偿制造商的支撑构建表面深度，从而确保的校准和打印体验。
弓形和曲率
一些建筑表面在其底部表现出弯曲或凸拱。这可能会给挤出生物打印带来问题，因为材料沉积是分层发生的。如果构建表面的一个点高于另一个点，则存在低通或高通不沉积的风险。
玻璃与塑料
虽然大多数培养皿和孔板都是塑料的，但玻璃是一种可以带来好处的替代品。玻璃具有更高的耐温性和耐化学性，而某些塑料可能会与某些生物墨水中使用的有机溶剂发生反应。玻璃的弯曲程度也较低。然而，在相同的尺寸下，玻璃更重、更昂贵。此外，碎玻璃会造成危险。您可以在其中任何一个上涂上细胞友好型涂层。对于某些粘性物质的打印，两者都可能过于光滑而无法沉积。在这种情况下，您可以使用不同的打印表面来增加表面的摩擦力。
基材刚度
细胞在仿生环境中存活得好。因此，细胞环境的几何形状和应力分布会影响细胞活力和分化。为了从您的细胞中获得良好结果，在构建表面引入额外的结构可能会有所帮助，以改变普通载玻片、板或培养皿的条件。
加热/冷却
组织工程中常使用的哺乳动物细胞受益于保持在接近哺乳动物体温的温度范围内。为了帮助重现这种效果，Allevi 3 系统有一个加热床板，可以升高到高达 60°C 的温度。 这对于较长的打印件特别有用。
有些材料对温度非常敏感，结构的机械性能可能会受到构建环境中保持的温度的影响。对于某些材料，如胶原蛋白，在温度受控（冷）的房间中进行打印可能会有所帮助。对于其他材料，建筑表面的不同温度可能足以引起热交联，从而增加建筑的结构完整性。
3D生物打印是3D打印在活细胞、生物分子和生物材料图案化中的应用。它允许对细胞环境变量进行微观控制，并对结构几何形状进行宏观控制。这很重要，因为人体中的细胞在三维的环境中发挥作用。重新创造这种环境使人们能够使用更具生理相关性的活组织模型。本文概述了经验丰富的研究人员用于进行实验并为他们的进一步研究提供信息的基本知识，重点是基于微挤出的 3D 生物打印。
选择细胞类型
要使用的细胞类型或细胞系将决定打印过程其余部分的许多限制。一些组织，如皮肤和肌腱，已经相当容易地生长成坚固的结构。其他的，如神经组织，可能很难处理。在细胞系的临床相关性和易用性之间取得平衡非常重要。您可能还需要考虑细胞的成熟度和来源。您的研究是否需要人类和非人类细胞之间的明确对比？您是否需要确保某种类型的人体组织在您的结构中工作？您是要打印一个模型生物系统，该模型系统需要发育的组织，还是需要证明您的工作可以促进细胞生长和分化？
或者，您选择的细胞系可能取决于您使用的墨水。例如，您可能有一种非常厚的新型墨水，需要相对较高的力才能挤出。像神经细胞这样的脆弱细胞对于这种墨水的实验来说可能是一个糟糕的选择。
细胞培养是在受控的实验室环境中培养细胞的过程。这是3D生物打印的一个重要方面，因为生物打印研究需要许多细胞。细胞培养通常从从相关细胞系购买细胞开始。
一旦您为您的目标选择了合适的细胞，您可能需要将您购买的样品培养成足够大的批量，以便在生物打印实验中使用。 对于载有细胞的生物墨水，细胞浓度范围为每毫升生物墨水 1-10 万个细胞。单个生物打印实验很容易需要 50 万个细胞。 在我们的指南中阅读更多关于细胞密度的信息 选择正确的细胞数量.
要为生物打印选择合适的细胞密度，您先需要考虑您的应用和您想要进行的终检测。本文将帮助您确定生物墨水的细胞密度。
体内细胞密度
身体的每个器官都有特定的细胞密度，但准确估计这个值并不容易?；诿庖呦赴?、DNA含量测量或数学计算有不同的方法[1]。例如，肝脏估计含有 1.3×1081克组织中的细胞[2]。这与体外细胞培养的平均细胞密度（约1×10）截然不同 5细胞/cm2更重要的是，组织密度是动态的，在生物体的发育过程中以及致病过程中可能会发生变化。
体外细胞密度
初接种在给定体外系统中的细胞数量会对培养结果产生重大影响?；虮泶铩⒎只?、增殖和细胞凋亡的密度依赖性调控是该方程式中的关键要素。具体参数将因细胞类型而异。 例如，已知癌细胞缺乏接触抑制机制，使它们能够以相对较高的密度生长而不会减少增殖[4,5]。细胞培养物的密度也会影响药物的积累，导致对测试化合物的不同反应[6]。鉴于所有这些事实，应优化和选择细胞密度，以在功能和生理上模仿天然组织。
生物学考虑
先，问自己以下问题：
您试图模仿的组织天然成分是什么？
您正在使用的细胞是增殖还是有丝分裂后？
您打算将构建体在细胞培养物中保留多长时间？
由于缺乏细胞间相互作用或生长因子分泌有限，因此细胞信号传导刺激不足，初始细胞数量过低可能会抑制细胞生长。如果构建体被设计为在体内移植，细胞数量也是一个重要参数。生物墨水中没有足够的细胞会导致与宿主组织的整合不良[8]。
另一方面，从过多的细胞开始会导致增殖的快速接触抑制、细胞簇的过度生长，从而导致缺氧条件的发展、营养流动受限或营养物质消耗迅速，并产生大量废物堆积。后一个考虑因素尤为重要，因为通常用于 2D 培养的培养基体积不足以支持高密度 3D 细胞构建体的生长。因此，如果培养基中含有酚红，并且观察到培养基颜色的快速变化，则可能表明应增加培养基体积，或更频繁地更换培养基[7,8]。高细胞浓度还可以对ECM产生、水凝胶重塑和为细胞创造合适的环境产生积极影响[9]。
机械注意事项
将细胞成分添加到您的生物材料中会改变其特性。高细胞密度会增加悬浮细胞的水凝胶的粘度[7]。更高粘度的生物墨水需要增加分配压力，这可能会对细胞活力产生负面影响[然而，这可以通过更大的喷嘴直径来补偿]。高细胞含量也会降低水凝胶硬度[9]。这些因素将影响沉积链的几何形状及其机械强度，因此，如果需要高分辨率和长期维护结构，则应根据生物墨水的细胞密度优化打印参数[10]。
细胞数量优化
为了优化应用的细胞数量，您应该从一系列不同的密度开始。您可以在下表 1 中找到一些 Allevi 作者在其出版物中使用的单元格编号。如果您打算使用类似的细胞和生物材料组合，这是一个很好的起点。
为获得终结果，请进行简单的生物相容性研究，包括生物墨水中几种浓度的细胞。先研究初始和终点细胞的活力和增殖。稍后，您可以更详细地检查功能结果。这将取决于您的实验，但请考虑终目标以及您的构建体应该反映什么：正确的药物反应、遵循体内发育或表达一些所需的标记物。对于终的生物打印，请记住调整打印条件以保持高细胞活力和分辨率。
生物墨水类型概述
生物墨水是用于3D生物打印的生物材料。生物墨水的材料特性会影响其与细胞的相互作用及其作为生物打印结构的成功。理解生物打印中使用的各种材料的一种方法是按它们在打印过程中的角色对它们进行分类。给定的生物墨水可以是基质墨水、支撑墨水或牺牲墨水。
基质墨水
基质生物墨水保持和支持细胞，在生物打印中起着重要作用。大多数基质生物墨水是水凝胶，这意味着它们主要由水组成。目前市场上的生物墨水具有优势和劣势，通常满足生物打印所需的部分但不是全部要求。其他类别的试剂可以帮助弥补这些弱点。有关基质油墨的一些示例及其主要用途。
支撑墨水
支持生物墨水是生物相容性材料，比基质墨水具有更好的机械性能。通常使用支持油墨来支持生物打印结构，因为水凝胶往往柔软且结构完整性低。支持生物墨水也常用于结缔组织或硬组织应用，例如软骨、骨骼或肌肉组织的制造。有关支撑油墨及其使用条件的一些示例，请参见下表。
牺牲墨水
顾名思义，牺牲生物墨水被设计为作为临时支撑物沉积，然后在后处理中移除。它们通常用于创建复杂的负几何形状，例如血管网络。在某些情况下，它们还可以用于提高使用本身形状保真度较差的材料制成的打印件的分辨率。有关支撑油墨及其使用条件的一些示例，请参见下表。
支撑墨水
虽然支撑和牺牲生物墨水可以提供持续或临时的加固，但这无助于仅由软水凝胶或其他几何复杂组成的结构。像FRESH这样的方法涉及打印到支撑槽中，从而能够创建这样的结构。
近端小管 STL 文件（左）、FRESH 浆液中的生物打印小管（中）、FRESH 后处理的小管（右）
交联固化剂
通过将细胞封装在生物墨水中，细胞能够在活组织中生长和重塑生物打印结构。使用天然生物墨水可以帮助他们做到这一点，因为它含有天然蛋白质。蛋白质对不同的组织类型是不同的，并增加了生物墨水的特异性，使它们能够针对特定应用进行定制。玻连蛋白或纤连蛋白等蛋白质在体内用于调节细胞行为，如粘附、迁移、增殖和分化，并介导与胶原蛋白、肝素和GAG的相互作用。
光引发剂
光交联是增加基质油墨硬度的几种交联选项之一，这在某些结构中是可取的。特别是光交联利用电磁辐射中的能量来激活硬化过程。光引发剂是将必要的自由基引入基质生物墨水以允许光交联的物质。它们主要在可以激活它们的电磁频谱范围内有所不同。
3D模型指南
在3D打印之前，你必须知道这个物体是什么样子的。无论该对象是简单的测试圆柱体还是复杂的血管网络，您通常都从 3D 模型开始，将该模型转换为 STL 文件，然后将该 STL 文件转换为 G 代码文件，您的打印机会将其解释为电机运动。下面，我们将讨论如何将您的打印对象从想法转化为 STL。
自己设计
有许多程序可以让您自己设计 3D 模型。这些通常被称为CAD（计算机辅助设计）程序。SolidWorks、Inventor 和 AutoCAD 都是流行的选项，但您可以探索很多选项。设计自己的模型的主要优点是可以控制形状。将模型雕刻成您喜欢的规格后，您可以将 CAD 文件另存为 STL 文件，然后就可以继续切片了。
从医学影像转换
许多研究人员在开发 3D 模型时使用的另一种技术是将医学成像样本转换为 STL 文件。CT 扫描是常见的转换成像类型，但可以使用大多数形式，特别是如果它们可以保存为 DICOM（医学数字成像和通信）文件。转换由软件执行，该软件将成像样品中记录的光强度转换为相应的组织类型，并确定组织之间的边界。Mimics、3D Slicer 和 InVesalius 3 等程序都是流行的选择。转换医学成像结果的主要优点是所生成模型的临床相关性。
使用数据库
如果您无法访问临床成像样本，有许多数据库可供选择，其中包含 DICOM 衍生的 STL。许多学术机构都有自己的图书馆，并且存在提供许可协议的私人馆藏。您可以在下面找到数据库列表。
打印参数
3D生物打印中使用的每种材料都需要不同的设置，以获得的挤出和干净的线条。打印参数可以在微观层面上影响结果，例如细胞活力，以及宏观结果，例如孔径和结构保真度。下面我们将讨论使用Allevi生物打印机进行气动挤出生物打印工艺的关键参数。
切片参数
切片，或将 STL 转换为 G 代码文件的过程，需要不同的设置，告诉软件如何将 STL 划分为多个层，以及打印机如何移动以创建结构。这些设置包括层高、喷嘴大小和打印速度。一般来说，层高与喷嘴尺寸密切相关，因为喷嘴往往具有圆形横截面。需要注意的是，打印速度是指挤出机相对于打印表面的运动，而不是挤出材料的流速。材料属性（如粘度）的变化会导致不同的材料在不同的设置下表现更好。例如，有些材料非常粘稠，挤出速度很慢，需要较慢的打印速度才能匹配。
需要注意的是，打印生物材料分辨率的限制因素是针头的直径。随着层高的降低和打印速度的提高，分辨率通常也会提高。但是，喷嘴尺寸越大、层高越大、打印速度越慢，挤出就越容易。这些参数之间的平衡通常是打印优化的主题，下面将对此进行讨论。选择这些参数后，可以将 STL 切片为 G 代码。
填充物是指印刷品特征表面或外壳内的材料。在其他 3D 打印应用中，填充通常由几何形状和占用体积百分比定义。Allevi 系统允许您在所选填充图案中设置填充线之间的距离，从而更地控制终结构。您需要填充物的形状和数量将因构建体的目的和您使用的细胞系而异。
打印机参数
准备好 G 代码后，您仍然需要为您的材料输入正确的打印机设置。在 气动挤出平台中，这些因素包括压力、温度和交联。
随着时间的流逝，我们已经优化了一些适用于一些常见生物材料的参数。这些通用打印参数非常适合刚开始使用新材料，并作为进一步优化的起点。
针
针头特征（如规格、长度、轮廓和材料）会显著影响您可以使用的压力、温度和速度。虽然针头的通常很明显，但请使用我们的针头选择指南来权衡所有因素。
交联
交联是软网络分子改变其相互作用的过程，导致材料变硬。这可以通过下面进一步讨论的几种机制来实现。采用可用于光交联的 LED。用于热交联的加热床板?；Ы涣部梢越柚蛴』浼ㄈ缗嘌蠛屯岽蛴∨缱欤┙欣谩?/p>
优化
应用各不相同，终结构的目标规格也各不相同。也许您追求速度和高吞吐量，或者您更专注于精细分辨率。无论哪种方式，优化打印参数都是关键步骤。
基材
常见类型的打印基材
构建表面有三种基本类型：载玻片、培养皿和孔板。载玻片可用于将构建体移动到显微镜上进行成像。培养皿提供了一个非常简单的构建环境，适合大型构建和测试?？装逦觳馓峁┓奖愕姆盅?。每种类型的行业标准部件配合使用。事实上，Allevi 1 和 Allevi 3 平台中的自动校准功能经过编程，可以补偿制造商的支撑构建表面深度，从而确保的校准和打印体验。
弓形和曲率
一些建筑表面在其底部表现出弯曲或凸拱。这可能会给挤出生物打印带来问题，因为材料沉积是分层发生的。如果构建表面的一个点高于另一个点，则存在低通或高通不沉积的风险。
玻璃与塑料
虽然大多数培养皿和孔板都是塑料的，但玻璃是一种可以带来好处的替代品。玻璃具有更高的耐温性和耐化学性，而某些塑料可能会与某些生物墨水中使用的有机溶剂发生反应。玻璃的弯曲程度也较低。然而，在相同的尺寸下，玻璃更重、更昂贵。此外，碎玻璃会造成危险。您可以在其中任何一个上涂上细胞友好型涂层。对于某些粘性物质的打印，两者都可能过于光滑而无法沉积。在这种情况下，您可以使用不同的打印表面来增加表面的摩擦力。
基材刚度
细胞在仿生环境中存活得好。因此，细胞环境的几何形状和应力分布会影响细胞活力和分化。为了从您的细胞中获得良好结果，在构建表面引入额外的结构可能会有所帮助，以改变普通载玻片、板或培养皿的条件。
加热/冷却
组织工程中常使用的哺乳动物细胞受益于保持在接近哺乳动物体温的温度范围内。为了帮助重现这种效果，Allevi 3 系统有一个加热床板，可以升高到高达 60°C 的温度。 这对于较长的打印件特别有用。
有些材料对温度非常敏感，结构的机械性能可能会受到构建环境中保持的温度的影响。对于某些材料，如胶原蛋白，在温度受控（冷）的房间中进行打印可能会有所帮助。对于其他材料，建筑表面的不同温度可能足以引起热交联，从而增加建筑的结构完整性。
3D生物打印是3D打印在活细胞、生物分子和生物材料图案化中的应用。它允许对细胞环境变量进行微观控制，并对结构几何形状进行宏观控制。这很重要，因为人体中的细胞在三维的环境中发挥作用。重新创造这种环境使人们能够使用更具生理相关性的活组织模型。本文概述了经验丰富的研究人员用于进行实验并为他们的进一步研究提供信息的基本知识，重点是基于微挤出的 3D 生物打印。
选择细胞类型
要使用的细胞类型或细胞系将决定打印过程其余部分的许多限制。一些组织，如皮肤和肌腱，已经相当容易地生长成坚固的结构。其他的，如神经组织，可能很难处理。在细胞系的临床相关性和易用性之间取得平衡非常重要。您可能还需要考虑细胞的成熟度和来源。您的研究是否需要人类和非人类细胞之间的明确对比？您是否需要确保某种类型的人体组织在您的结构中工作？您是要打印一个模型生物系统，该模型系统需要发育的组织，还是需要证明您的工作可以促进细胞生长和分化？
或者，您选择的细胞系可能取决于您使用的墨水。例如，您可能有一种非常厚的新型墨水，需要相对较高的力才能挤出。像神经细胞这样的脆弱细胞对于这种墨水的实验来说可能是一个糟糕的选择。
细胞培养是在受控的实验室环境中培养细胞的过程。这是3D生物打印的一个重要方面，因为生物打印研究需要许多细胞。细胞培养通常从从相关细胞系购买细胞开始。
一旦您为您的目标选择了合适的细胞，您可能需要将您购买的样品培养成足够大的批量，以便在生物打印实验中使用。 对于载有细胞的生物墨水，细胞浓度范围为每毫升生物墨水 1-10 万个细胞。单个生物打印实验很容易需要 50 万个细胞。 在我们的指南中阅读更多关于细胞密度的信息 选择正确的细胞数量.
要为生物打印选择合适的细胞密度，您先需要考虑您的应用和您想要进行的终检测。本文将帮助您确定生物墨水的细胞密度。
体内细胞密度
身体的每个器官都有特定的细胞密度，但准确估计这个值并不容易?；诿庖呦赴?、DNA含量测量或数学计算有不同的方法[1]。例如，肝脏估计含有 1.3×1081克组织中的细胞[2]。这与体外细胞培养的平均细胞密度（约1×10）截然不同 5细胞/cm2更重要的是，组织密度是动态的，在生物体的发育过程中以及致病过程中可能会发生变化。
体外细胞密度
初接种在给定体外系统中的细胞数量会对培养结果产生重大影响?；虮泶铩⒎只?、增殖和细胞凋亡的密度依赖性调控是该方程式中的关键要素。具体参数将因细胞类型而异。 例如，已知癌细胞缺乏接触抑制机制，使它们能够以相对较高的密度生长而不会减少增殖[4,5]。细胞培养物的密度也会影响药物的积累，导致对测试化合物的不同反应[6]。鉴于所有这些事实，应优化和选择细胞密度，以在功能和生理上模仿天然组织。
生物学考虑
先，问自己以下问题：
您试图模仿的组织天然成分是什么？
您正在使用的细胞是增殖还是有丝分裂后？
您打算将构建体在细胞培养物中保留多长时间？
由于缺乏细胞间相互作用或生长因子分泌有限，因此细胞信号传导刺激不足，初始细胞数量过低可能会抑制细胞生长。如果构建体被设计为在体内移植，细胞数量也是一个重要参数。生物墨水中没有足够的细胞会导致与宿主组织的整合不良[8]。
另一方面，从过多的细胞开始会导致增殖的快速接触抑制、细胞簇的过度生长，从而导致缺氧条件的发展、营养流动受限或营养物质消耗迅速，并产生大量废物堆积。后一个考虑因素尤为重要，因为通常用于 2D 培养的培养基体积不足以支持高密度 3D 细胞构建体的生长。因此，如果培养基中含有酚红，并且观察到培养基颜色的快速变化，则可能表明应增加培养基体积，或更频繁地更换培养基[7,8]。高细胞浓度还可以对ECM产生、水凝胶重塑和为细胞创造合适的环境产生积极影响[9]。
机械注意事项
将细胞成分添加到您的生物材料中会改变其特性。高细胞密度会增加悬浮细胞的水凝胶的粘度[7]。更高粘度的生物墨水需要增加分配压力，这可能会对细胞活力产生负面影响[然而，这可以通过更大的喷嘴直径来补偿]。高细胞含量也会降低水凝胶硬度[9]。这些因素将影响沉积链的几何形状及其机械强度，因此，如果需要高分辨率和长期维护结构，则应根据生物墨水的细胞密度优化打印参数[10]。
细胞数量优化
为了优化应用的细胞数量，您应该从一系列不同的密度开始。您可以在下表 1 中找到一些 Allevi 作者在其出版物中使用的单元格编号。如果您打算使用类似的细胞和生物材料组合，这是一个很好的起点。
为获得终结果，请进行简单的生物相容性研究，包括生物墨水中几种浓度的细胞。先研究初始和终点细胞的活力和增殖。稍后，您可以更详细地检查功能结果。这将取决于您的实验，但请考虑终目标以及您的构建体应该反映什么：正确的药物反应、遵循体内发育或表达一些所需的标记物。对于终的生物打印，请记住调整打印条件以保持高细胞活力和分辨率。