緩沖液是一種含有弱酸及其共軛堿（或弱堿及其共軛酸）的水溶液。加入少量強酸或強堿后，緩沖溶液的 pH 值變化很小，當小的環(huán)境因素發(fā)生變化時，有助于抵消分析方法中的條件變化。緩沖溶液用于將 pH 值保持在幾乎恒定的值。由于這種弱酸 (HA) 與其共軛堿之間存在平衡，它們對 pH 變化具有抵抗力。
一、hplc緩沖液的工作原理
當一些強酸（更多的 H+）被添加到弱酸及其共軛堿的平衡混合物中時，根據(jù) Le Chatelier 原理，平衡向左移動。類似地，如果將強堿添加到混合物中，則氫離子濃度降低的量小于所添加堿量的預期量。
在準備緩沖液時，您應該遵守一些一般準則：
校準 pH 計；理想情況下，pH 值高于和低于緩沖液制備的目標值；
稱出緩沖鹽以提供所需的緩沖濃度；
加入裝有 HPLC 級水的容量瓶中，充分混合溶解；
使用 pH 探針和 pH 計，測量溶液的 pH；
通過添加少量強酸和/或強堿將 pH 值調(diào)節(jié)至所需值；
一旦 pH 值正確，將溶液稀釋至最終所需體積并充分混合。
在 HPLC 中，緩沖液通常用于控制在色譜領域中通常被視為“不需要"的二級相互作用。它們還用于控制分析物的電離狀態(tài)，以確保它不會以一種以上的電離狀態(tài)存在?；衔锏?pKa 表示其 50% 離子化和 50% 中性的 pH 值。如果您在這個 pH 值下工作，您將看到分裂峰和可變的保留時間。所有方法都應努力使其遠離目標分析物的 pKa 至少兩個 pH 單位。
二、準備好的流動相
在制備等度流動相時，需要進一步考慮以確保良好的方法穩(wěn)定性。
盡可能預混合您的流動相，這將消除泵的錯誤。始終使用相同的方法進行準備；例如，如果您先加水，則應始終先加水。如果您測量單個組件然后混合，則應始終以這種方式進行。請勿更改此過程，因為分析物保留時間的結果可能會有很大差異。
HPLC 中分析物的保留時間由流動相的極性控制。HPLC 的流動相通常使用可混溶的有機溶劑和水/緩沖液的非極性和極性混合物/組合。選擇合適的流動相是 HPLC 方法開發(fā)的一個重要方面。在使用流動相和緩沖液之前，應使用溶劑進樣口過濾器將其過濾，并對所有水性和有機溶劑進行脫氣，以去除所有顆粒雜質(zhì)并溶解氣體。不銹鋼材質(zhì)更耐腐蝕，無需工具或配件，有效防止顆粒進入您的泵。
三、準備好的流動相
緩沖液濃度也很重要，通常認為低于 10mM 的濃度不能提供控制硅醇活性或化合物的電離狀態(tài)所需的緩沖能力，而 10mM 將被認為是反相和 HILIC 的最小有效濃度。對于其他技術（例如尺寸排除），需要顯著更高的濃度，并且這些方法的濃度超過 100 mM 的情況并不少見。緩沖液濃度必須仔細平衡，以確保在所有條件下都能達到溶解度。在反相條件下工作時，如果方法包含高水平的有機物（例如跨梯度），您可能需要限制正在使用的緩沖液的濃度，以確保不會發(fā)生緩沖液沉淀。
檢查所用溶劑的相容性、相對極性和混溶性。流動相僅使用高純度溶劑，水應為 HPLC 級或過濾和去離子，一般透明玻璃瓶用于儲存流動相，因為玻璃具有化學惰性，便于目視檢查。
流動相對選擇性的貢獻不亞于固定相，在開發(fā)穩(wěn)健的 HPLC 色譜方法時，選擇和制備的注意與批量測試固定相同樣重要。
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