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HPLC 色譜柱挑選指南

閱讀:2655      發(fā)布時(shí)間:2022-3-16
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        一、分離模式

        選擇色譜柱的首要任務(wù)是選擇分離模式。分離分子的方法有很多,其中應(yīng)用*泛的包括反相、正相、親水相互作用、離子交換和尺寸排阻 HPLC。還有一些不太常見但更專業(yè)的分離模式,例如使用手性固定相或流動(dòng)相的特定手性色譜。

        反相色譜柱通常用于非極性或弱極性有機(jī)化合物,它包含非極性固定相(如 C18),通常與極性流動(dòng)相配對(duì)。恒譜生C18 AQ 反相色譜柱在水下?lián)碛?產(chǎn)品的壽命,適于極性較大的物質(zhì)在高水相條件下的分析。但是該方法不適合應(yīng)用于蛋白質(zhì),流動(dòng)相通常含有低 pH 值的乙腈或甲醇,可能會(huì)使蛋白質(zhì)變性,因此會(huì)產(chǎn)生偽峰或?qū)е碌鞍踪|(zhì)聚集和色譜柱堵塞。

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        二、柱長(zhǎng)

        確定分離模式和色譜類型后,請(qǐng)考慮色譜柱長(zhǎng)度。理想的柱長(zhǎng)在某種程度上取決于您的特定樣品和分離模式。一般來(lái)說(shuō),更長(zhǎng)的色譜分析柱需要更長(zhǎng)的運(yùn)行時(shí)間,但會(huì)產(chǎn)生更好的分離效果。柱長(zhǎng)(有時(shí)稱為“床高”)對(duì)于根據(jù)大小分離蛋白質(zhì)特別重要。

        三、填料的大小和類型

        HPLC 柱床由直徑通常為 2 至 10 μm 的球形功能顆粒構(gòu)成。小于 2 μm 的粒徑用于UHPLC,超高壓液相色譜是在非常高的壓力下運(yùn)行,因此它使用比 HPLC 更小的顆粒。恒譜生2μm硅膠基質(zhì)色譜填料,孔分布均勻、抗壓強(qiáng)度高,由于表面羥基活性高所以在中高壓情況下能達(dá)到快速分離純化的效果。一般而言,較小的粒徑可提供更高的分離率——但需要注意的是背壓也更大,以便將流動(dòng)相泵入密度更大的色譜柱。

 

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        三、色譜填料的材料

        常見的選擇有二氧化硅、羥基磷灰石和交聯(lián)聚合物樹脂。常見的疏水烷基鏈有 C4、C8 和 C18 等長(zhǎng)度。通常,該材料對(duì)目標(biāo)分析物具有一定程度的選擇性——做出這種選擇對(duì)于優(yōu)化分離度很重要。例如,C18 更常用于分離肽或小分子,而 C4 更適用于蛋白質(zhì)。

        技術(shù)發(fā)展也產(chǎn)生了新的粒子類別。一種稱為表面多孔顆粒 (SPP) 或核殼顆粒的新型二氧化硅基材料有望實(shí)現(xiàn)通過(guò)2 μm的粒徑實(shí)現(xiàn)更高的分離效率。通常,常規(guī)粒徑小于 2 μm 的 HPLC 色譜柱需要專門的 UHPLC 泵或系統(tǒng)來(lái)處理較高的背壓。與球形和全多孔的傳統(tǒng)二氧化硅顆粒不同,SPP 顆粒由一個(gè)實(shí)心二氧化硅核組成,其上覆有多孔二氧化硅殼,這些顆粒的優(yōu)點(diǎn)是它們表現(xiàn)出像 2 微米顆粒一樣的效率,顆粒尺寸從 2.6 微米及以上,但在略高于一半的背壓下運(yùn)行。

 

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