應(yīng)用簡介
簡單來講，CRISPR/Cas9是一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過這種技術(shù)科研人員可以對(duì)細(xì)胞和生物體內(nèi)的基因進(jìn)行編輯。所謂的基因編輯就是通過某種生物手段和技術(shù)，對(duì)生物體內(nèi)的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修改。基于原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)研發(fā)出的CRISPR/Cas9技術(shù)只包含兩種重要的成分，一種是行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白，而另一種則是具有導(dǎo)向功能的sgRNA（single guide RNA）。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)sgRNA和Cas9蛋白時(shí)，Cas9蛋白通過與sgRNA結(jié)合，靶向到目的DNA序列上發(fā)揮DNA雙鏈切割的功能。DNA序列被切割產(chǎn)生斷裂后，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)部的DNA修復(fù)機(jī)制（DNA repair）。真核細(xì)胞同時(shí)存在著同源重組修復(fù)和非同源重組修復(fù)。在同源重組修復(fù)下，斷裂的染色體以另一條完整的姐妹染色單體為模板進(jìn)行DNA修復(fù)，而在非同源重組修復(fù)下，斷裂出的DNA隨機(jī)修復(fù)，引入新的堿基，使基因產(chǎn)生移碼突變。
技術(shù)原理
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通過堿基配對(duì)與 tracrRNA (trans-activating RNA) 結(jié)合形成 tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)處剪切雙鏈 DNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA序列進(jìn)行編輯；而通過人工設(shè)計(jì)這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的gRNA (guide RNA)，用以引導(dǎo) Cas9 對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割。
靶位點(diǎn)的選擇要求：
1、靶位點(diǎn)主要包括20 個(gè)堿基，并且這20個(gè)堿基后面是NGG的PAM 區(qū)；
2、靶位點(diǎn)盡量選擇在基因編碼區(qū)的前端；
3、轉(zhuǎn)化應(yīng)選擇對(duì)應(yīng)抗性的LB平板培養(yǎng)基。
實(shí)驗(yàn)方法

技術(shù)總結(jié)
Crispr/Cas9慢病毒特點(diǎn)：
1、適用于在同一個(gè)細(xì)胞系中需要進(jìn)行多個(gè)基因敲除的實(shí)驗(yàn)；
2、基因敲除效率比直接質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更高；
3、提供多種不同熒光和抗性標(biāo)記的慢病毒表達(dá)載體，更易篩選到基因敲除成功細(xì)胞；
4、接受cas9蛋白穩(wěn)定表達(dá)不同細(xì)胞系定制。
Crispr/Cas9腺病毒特點(diǎn)：
1、可感染多種分裂期和非分裂期細(xì)胞，感染效率高、敲除效率高；
2、操作簡單，容易掌握；
3、基因敲除周期短，成本低；
4、適合哺乳動(dòng)物不同種屬不同基因的操作，適用范圍廣。

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