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原代細胞分離與培養(yǎng)科研實驗技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀：75 發(fā)布時間：2024-9-19應(yīng)用簡介
凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。通過原代分離獲得的細胞具有與體內(nèi)細胞相似的生物學特征，是研究生物體相關(guān)生命活動的理想材料。
原理介紹
原代細胞的分離是將人/小鼠等特異模式動物的細胞從機體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖的過程。原代培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。zui常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。
實驗方法
一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。
三、小鼠肝細胞原代培養(yǎng)
流程圖：
1、原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取繁殖能力較強的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。
2、要注意無菌操作。其操作要求應(yīng)高于外科手術(shù)、
3、整個取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇時間1min左右，不能過長，以確保胚胎細胞活性。
4、運用消化法時胰酶溫度應(yīng)低于37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養(yǎng)細胞時的1~10min，而是至少20min，先消化下來的細胞在此胰酶消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以胰酶不能作用過強，否則這些細胞易被損傷而不易生存。
5、如使用組織塊法，則應(yīng)待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸，匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁，則細胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。
6、原代培養(yǎng)操作時，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。
7、本實驗也可以使用新生乳鼠做培養(yǎng)材料。此時要將乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮膚充分消毒，由于乳鼠原代培養(yǎng)污染概率更高，故應(yīng)小心操作，避免污染細菌。乳鼠原代培養(yǎng)細胞的存活率不及胚胎細胞培養(yǎng)的成功率。