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技術(shù)文章

原代細胞分離與培養(yǎng)科研實驗技術(shù)服務(wù)介紹

閱讀:75          發(fā)布時間:2024-9-19
原代細胞分離與培養(yǎng)

應(yīng)用簡介
       凡是來源于胚胎、組織器官及外周血,經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。通過原代分離獲得的細胞具有與體內(nèi)細胞相似的生物學特征,是研究生物體相關(guān)生命活動的理想材料。
原理介紹
       原代細胞的分離是將人/小鼠等特異模式動物的細胞從機體中取出,經(jīng)胰酶、螯合劑(常用EDTA)處理,分散成單細胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖的過程。原代培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此,較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng),此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì),如果是正常細胞,仍然保留二倍體數(shù)。但實際上,通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。zui常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。
實驗方法
一、懸浮細胞的分離方法
       組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,可采用低速離心。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
       對于實體組織材料,由于細胞間結(jié)合緊密,為了使組織中的細胞充分分散,形成細胞懸液,可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。其中,機械分散法的特點是簡便、快速,但對組織機械損傷大,而且細胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊(或糊狀),應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動,使團塊膨松,由塊狀變成絮狀,此時再采用機械法,用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,使細胞團塊得以較充分的分散,制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液,接種培養(yǎng)后,細胞容易貼壁生長。
三、小鼠肝細胞原代培養(yǎng)
流程圖:

技術(shù)總結(jié)
       1、原代培養(yǎng)材料的選擇,盡量選取繁殖能力較強的組織,如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。
       2、要注意無菌操作。其操作要求應(yīng)高于外科手術(shù)、
       3、整個取材操作要迅速,尤其孕鼠浸泡乙醇時間1min左右,不能過長,以確保胚胎細胞活性。
       4、運用消化法時胰酶溫度應(yīng)低于37℃,濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養(yǎng)細胞時的1~10min,而是至少20min,先消化下來的細胞在此胰酶消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以胰酶不能作用過強,否則這些細胞易被損傷而不易生存。
       5、如使用組織塊法,則應(yīng)待組織塊略干燥,能黏附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸,匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁,則細胞不易生長,即使生長也因沒有貼在瓶壁上,從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。
       6、原代培養(yǎng)操作時,也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。
       7、本實驗也可以使用新生乳鼠做培養(yǎng)材料。此時要將乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮膚充分消毒,由于乳鼠原代培養(yǎng)污染概率更高,故應(yīng)小心操作,避免污染細菌。乳鼠原代培養(yǎng)細胞的存活率不及胚胎細胞培養(yǎng)的成功率。


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